复方黄连消疮灵治疗复发性口腔溃疡的免疫学机制研究

杨志诚，吴丽芳，郭其，张君利，吕剑涛,3*

(1.滨州医学院烟台附属医院，山东 烟台 264100;2.烟台市福山区人民医院， 山东 烟台 264100;3.山东中医药大学，山东 济南 250101)

复发性口腔溃疡(ROU)为临床上常见的口腔黏膜病变之一，发病率高达20%。其与中医学中的“口疮”或“口疡”极其相似，中医学对其病因病机的认识主要集中在“阴虚火旺”和“心脾积热”两方面，由于ROU的病因和发病机制不明，目前尚无特效治疗方法[1-3]。复方黄连消疮灵为临床上治疗ROU的常用药，疗效显著。本研究将其作用于复发性口腔溃疡模型大鼠，通过观察外周血中T细胞亚群比例(CD3+、CD4+、CD8+)的变化探讨其可能的作用机制，以达到为临床提供用药参考的目的。

1 材料与仪器

1.1 药物

处方由黄连、青黛、石膏、硼砂、乳香、没药、珍珠、冰片组成，均由滨州医学院烟台附属医院中药房提供。

1.2 制备方法

将八味中药按原处方比例称取药材，加入适量水，浸泡l h，回流提取2次(第1次以10倍量水提取2 h，第2次以8倍量水提取1.5 h)，合并提取液，浓缩，减压干燥得干浸膏，备用，1 g相当于6.37 g生药量。

1.3 动物

SD大鼠110只，SPF级，雌雄各半，体质量180～200 g，由维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.4 仪器及试剂

组织匀浆器(南京建成生物工程研究所)；高速离心机(北京时代北利离心机有限公司)；完全费氏佐剂(美国Sigma公司)；电子天平(梅特勒上海有限公司)；guava easyCyte 5HT流式细胞仪(美国Millipore公司)。

2 方法

2.1 对复发性口腔溃疡大鼠影响

取健康SD大鼠10只，腹腔注射戊巴比妥钠(35 mg/kg)麻醉大鼠，将0.1 ml生理盐水皮下注射于口腔黏膜下，取下凸起的口腔黏膜，生理盐水冲洗3次，使用玻璃研钵磨碎，加入0.1 ml、pH值7.4的PBS缓冲液，继续研磨成匀浆，低温冰箱保存备用。在制作大鼠模型时，加入等体积的完全弗氏佐剂，在振荡器上振摇2～5 min充分混匀，混匀后的试液呈乳状且放置不分层。除正常对照组外将现用现配的组织乳化剂皮内注射于大鼠背部脊柱两侧(100只)，各0.1 ml，1次/周，共4次，正常对照组大鼠相同部位注射等容量的生理盐水。5周后观察发现,注射了抗原乳化液的模型大鼠大多数出现口腔溃疡，正常对照组未见有口腔溃疡的发生，黏膜红润。

取造模成功大鼠50只，随机分为复方黄连消疮灵高剂量组(1.8 g/kg生药量)、复方黄连消疮灵中剂量组(0.9 g/kg生药量)、复方黄连消疮灵低剂量组(0.45 g/kg生药量)、模型对照组、左旋咪唑组(20 mg/kg)、每组10只。在第5周复发性口腔溃疡模型造模成功后采用灌胃给药，模型、正常对照组大鼠均灌胃给予等容量的纯水，每日1次，共14 d。密切观察并记录各组大鼠发生溃疡的持续时间和数目。

在给药14天后，腹腔注射戊巴比妥钠(35 mg/kg)麻醉大鼠，腹主动脉取血3 mL，置肝素抗凝管中摇匀，然后吸取抗凝全血,在不破坏液体交界面的前提下加至等量淋巴细胞分层液的上层。2 500 r/min离心10 min，使用吸管将中间白色细胞层吸出置于新的试管中。加入3 mL pH值7.2～7.4缓冲液混匀，然后1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，再加入200 μL缓冲液混匀，使用血球计数板对淋巴细胞计数，调整各待测管的细胞浓度分别为2×106/mL。吸取调整后的细胞100 μL置于离心管中，分别加入单克隆抗体，振荡混匀，4℃避光染色30 min。以1 000 r/min离心5 min，弃去上清液；每管加入300 μL缓冲液，混匀，使用流式细胞仪检测[4-7]。

2.2 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件进行方差分析，如果方差齐，则使用LSD检验，如果方差不齐，则使用Dunnett T3，以P≤0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对复发性口腔溃疡大鼠溃疡数目、持续时间影响

与模型对照组比较，复方黄连消疮灵高、中剂量组、左旋咪唑组可以显著缩短溃疡的持续时间，减少溃疡数目(P<0.01，P<0.05)。具体结果见表1。

表1 对复发性口腔溃疡大鼠溃疡数目、持续时间的影响

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

3.2 对复发性口腔溃疡大鼠T细胞亚群比例的影响

与模型对照组比较，复方黄连消疮灵高剂量组、左旋咪唑组可以显著升高CD3+CD4+细胞水平(P<0.05)；但对CD3+CD8+细胞水平影响不明显(P>0.05)；复方黄连消疮灵高剂量组、左旋咪唑组可以显著升高CD4+/CD8+比值水平(P<0.05)。具体结果见表2。

表2 对复发性口腔溃疡大鼠T细胞亚群比例影响

注：与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

4 讨论

复发性口腔溃疡的病因至今仍不明确，大多间歇性发作，且表现出自限性，本病多在1～2周内即可自愈，愈后良好，多不留瘢痕；有局限性口腔黏膜溃疡性损伤的特点，常常表现为进食、说话时疼痛，影响患者的工作、生活，且长期溃疡不愈易出现恶变[8-9]。

复方黄连消疮灵由黄连、青黛、石膏、硼砂、乳香、没药、珍珠、冰片8味中药组成，以清热祛湿、泻火解毒为法，在临床应用中取得了较好的疗效。复方黄连消疮灵以黄连、青黛为君药，清热凉血解毒;以石膏、硼砂、乳香为臣药，解肌清热消肿、血分虚实之热;佐以没药、珍珠，定痛收敛生肌;使以冰片，通诸窍散郁火。

T淋巴细胞是人体内参与免疫应答的重要细胞，发挥着机体的免疫监视功能，正常机体的T淋巴细胞各亚群之间是相互平衡、相互调节的，从而使机体发挥正常的免疫应答作用，对外来抗原产生刺激，使机体的免疫应答处于平衡状态。如果平衡被破坏免疫调节紊乱，必将导致疾病的发生，目前医学临床上免疫状态检测指标主要是CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群在血液中的分布。聂建芳等[8]对138例ROU患者进行治疗，用细胞流式仪检测患者治疗前后外周血T淋巴细胞亚群水平，经过治疗后，ROU患者血T淋巴细胞亚群平衡发生改观并伴随症状改善。功能性T淋巴细胞的特异性是预防自身特异性疾病的重要屏障，组织特异性T细胞减少可导致局部口腔溃疡的发生[10-11]。鉴于此，本研究从T细胞亚群的角度探讨复方黄连消疮灵治疗ROU的作用机制，检测模型大鼠给药后CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群细胞比例的变化。结果显示，治疗后ROU模型大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+细胞比例均显著升高，提示复方黄连消疮灵治疗ROU的作用机制与改善T细胞亚群的比例有关。

综上所述，复方黄连消疮灵可以显著缩短溃疡的持续时间，减少溃疡数目；这可能是通过改善T细胞亚群的比例，从而达到治疗复发性口腔溃疡的目的。

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