大黄蛰虫丸对大鼠深静脉血栓形成模型TNOS、iNOS及超微结构的影响

回雪颖，郭伟光，滕林，张海丽，于洋

(黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

下肢深静脉血栓形成(Deep venous thrombosis，DVT)是周围血管病中常见的静脉系统疾病，属中医学“股肿”范畴。本实验通过建立大鼠深静脉血栓形成模型，观察大黄蛰虫丸对DVT总一氧化氮合酶(TNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及光、电镜下静脉标本超微结构的影响，证实大黄蛰虫丸对DVT的疗效并探讨其作用机理。

1 实验材料

1.1 实验动物

12周龄清洁级Wistar大鼠48只，雌雄各半，体质量200～220 g，购自哈尔滨医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂

一氧化氮合酶(NOS)检测分型试剂盒(武汉建成生物工程研究所)。

1.3 主要材料及器械

碘伏消毒液(上海利康消毒高科技有限公司)；组织剪、外科显微剪、显微镊、显微血管夹等(上海手术器械厂)；非吸收性外科丝线(杭州华威医疗用品有限公司)；吸收性明胶海绵(南昌市祥恩堂医疗器械有限公司)。

1.4 主要仪器

LDZ4-2自动平衡离心机(江苏省金坛市医疗仪器厂)；722型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；日本OLYMPAUS BH-2光学显微镜；荷兰TECNAI G2透视电镜；德国莱卡2135型切片机；美国moticam3000显微摄影成像系统。

1.5 受试药物

实验组使用药物为大黄蛰虫丸。药物组成：熟地黄、土虫、水蛭、虻虫、蛴螬、干漆、桃仁、苦杏仁、黄芩、地黄、白芍、甘草。吉林省健今药业股份有限公司，国药准字Z19990064。将大黄蛰虫丸(3 g/丸)用蒸馏水调匀，制成悬浊液。

对照组使用药物为通塞脉片。药物组成：玄参、金银花、当归、黄芪、党参、牛膝、石斛、甘草。江苏南星药业有限公司，国药准字232020535。将通塞脉片(0.35 g干浸膏/片)研为细末，用蒸馏水制成悬浊液。

2 实验方法

48只Wistar大鼠随机分为6组，即空白对照组、大黄蛰虫丸高、中、低剂量组、通塞脉片组、模型组，每组8只，雌雄各半。

按临床等效剂量为低剂量组得出，大黄蛰虫丸低、中、高剂量分别为0.54 g/kg、1.08 g/kg和2.16 g/kg，通塞脉片用量为0.57 g/kg。灌胃给药，每次2 ml，每日1次。空白对照组及模型组采用生理盐水灌胃，每次2 ml，每日1次。

各组按体质量灌胃给药10天。末次给药2 h后，以10%的乌拉坦按0.1 ml/kg体质量腹腔麻醉，腹中部去毛，常规消毒，铺巾，沿腹正中线剪开至肌层，腹腔暴露，生理盐水纱布包裹移出肠管后，将其置于腹部右侧。打开后腹膜，游离下腔静脉与左肾静脉汇合处，用4#外科非吸收性丝线于左肾静脉下方结扎下腔静脉，将肠管回纳腹腔，用1#丝线依次连续缝合腹壁和皮肤，建立大鼠深静脉血栓形成模型。术后6 h，开腹，心脏取血，离心10 min取血清，用722型可见分光光度计测定TNOS、iNOS；并取下腔静脉血管标本，分别置于10%甲醛及10%多聚甲醛中固定，镜检。

TNOS、iNOS检测原理：一氧化氮合酶催化L-精氨酸和分子氧反应生成NO，其与亲核性物质生成有色化合物，在530 nm波长下检测吸光度，依据吸光度的大小计算出NOS活力。

3 统计学处理

4 结果

4.1 大黄蛰虫丸对TNOS、iNOS的影响

如表1所示，大黄蛰虫丸、通塞脉片均可升高模型大鼠的TNOS含量，与模型组比较均有统计学意义(P<0.05)。大黄蛰虫丸、通塞脉片均可降低模型大鼠的iNOS含量，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 大黄蛰虫丸对各组大鼠TNOS、iNOS的影响

注：与模型组比较，▲P<0.05；与空白对照组比较，★P<0.05，☆P>0.05；与通塞脉片组比较，※P>0.05

4.2 大黄蛰虫丸对模型大鼠超微结构的影响

4.2.1 光镜下组织学观察

与空白对照组比较，模型组的血管内膜不规则，血管内皮细胞不全，但其脱落不明显，管壁不连续，管腔内可见血栓形成，与血管壁无黏连。大黄蛰虫丸组及通塞脉片组血管内膜较规则，内皮相对完好，部分内皮细胞脱落，血管壁较连续，管腔内可见少量血栓形成，相对通畅。结果见图1。

图1 各组大鼠深静脉血栓形成模型光镜结果

4.2.2 电镜下组织学观察

与空白对照组比较，模型组镜下可见充满血栓和炎性细胞，并可见血小板颗粒特征，可见肌层或表皮中层的破坏。大黄蛰虫丸组及通塞脉片组镜下可见中膜下有少量渗出及炎性细胞或中层较完好，内皮较连续，管腔内少有聚集血小板，内皮细胞胞浆较饱满。结果见图2。

图2 各组大鼠深静脉血栓形成模型电镜结果

5 讨论

下肢深静脉血栓形成多由于创伤、手术、妊娠及其他长期卧床等因素所致，发病率较高。其并发症肺栓塞具有致命风险。据报道约有50%的DVT患者由于认识不足、延误治疗演变成下肢深静脉血栓形成后遗症(Deepvenous postthrombotic syndrome DVTS)[1-3]，包括下肢肿胀、色素沉着、溃疡等，严重影响患者的日常生活和工作。

中医学认为,深静脉血栓形成属于“股肿”“脉痹”等范畴，早在《黄帝内经》中就有对本病的描述。《血证论》指出：“瘀血流注，亦发肿胀，乃血变成水之证。”《医宗金鉴》提到：“产后闪挫，瘀血作肿者，瘀血久滞于经络，忽发则木硬不红微热。”故本病是因创伤、产后或术后长期卧床导致气虚或气滞，使血行不畅，瘀阻脉络，营血回流受阻，聚而为湿所致。《内经》提到“血实者宜决之”，用大黄蛰虫丸以祛瘀生新。大黄蛰虫丸源自张仲景的《金匮要略》，具有攻补兼施的特点。方中大黄清热活血化瘀，《本经》中描述其：“下瘀血，血闭寒热，破癥瘕积聚”；蛰虫破血逐瘀，《长沙药解》曰：“(蛰虫)本品善化瘀血，最补损伤”，二者共为君药，能行能和，通达三焦以除瘀血。臣以水蛭、虻虫、蛴螬、煅干漆、桃仁活血搜络化瘀，共助君药攻逐瘀血，《本经》中介绍水蛭“主逐恶血、瘀血”；虻虫“逐瘀血，破下血积”；《长沙药解》：“蛴螬，能化瘀血，最消癥块。”《珍珠囊》“(桃仁)治血结……，破蓄血”。佐以黄芩清解郁热；苦杏仁宣肺气，润肠道，配伍桃仁，降肺气，开大肠以利瘀血；地黄、白芍养血润燥，缓中补虚，以助生新。甘草益气和中，调和药性，为佐使药。

诸药合用，祛瘀而不伤正，扶正而不留瘀。虫类药物，搜剔钻透，直达病所，合用后破血逐瘀之力峻猛，瘀血重症，非其不足以祛除。此方体现张仲景用药严谨，寓意良深。

现代医学认为血流缓慢、血液高凝和静脉壁损伤是静脉血栓形成三大因素[4]。总一氧化氮合酶(TNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)可引起血液高凝状态。TNOS有三种亚型同功酶，包括神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS )以及iNOS，其中iNOS正常情况下在细胞内不表达，只有在损伤后诱导表达[5]。iNOS激活后活性持续时间长，可诱导持续大量释放超出生理浓度的一氧化氮[6]，活性氮氧终产物生成增多，导致脂质过氧化，细胞坏死，释放更多的炎性介质，从而易形成血栓。现代药理研究表明，蛰虫中含有丝氨酸蛋白酶，可以激活人体血纤溶酶原。水蛭素有抗凝、抗血栓、抗血小板凝聚作用，促进新生血管的生成[7]，水蛭素和凝血酶结合后可抑制凝血酶上的纤维蛋白原结合位点，使纤维蛋白原不能转变为纤维蛋白，从而抑制凝血过程[8]。桃仁有抗凝作用，对血流阻滞、血行障碍有改善作用。

本研究中大黄蛰虫丸能够降低模型大鼠血清中的iNOS，升高血清中的TNOS含量。光镜及电镜下血栓模型组血管内皮不同程度破坏，但大黄蛰虫丸能显著改善其状态，且高剂量组保护血管内皮比中、低剂量组明显。上述实验结果说明大黄蛰虫丸有良好的预防血栓及保护内皮作用，为临床应用提供了可靠的理论依据。

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