针刺“百会”透“曲鬓”对ICH大鼠脑水含量及IL-1β mRNA表达的影响

刘晓莹，邹伟，于学平

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040)

脑出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)指原发性非外伤性脑实质内出血，全球每年约有200万人患病[1-4]，是一种病情危急，拥有高致残率和高死亡率的疾病。炎症反应参与了脑出血的发生和病情发展，IL-1β作为免疫反应的中央协调器和炎症反应的关键触发点，其表达情况直接体现脑出血炎症反应的程度[5]。针灸治疗脑出血疗效已得到广泛肯定，对其作用机制的研究也成为人们关注的热点。本研究利用大鼠脑出血模型，观察针刺对ICH大鼠脑组织IL-1β mRNA及血清IL-1β表达的影响，探究针刺治疗脑出血可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

将162只成年健康雄性SD大鼠(哈尔滨市兽医研究所)，体质量(300±20)g，随机分为假手术组(S,n=18)、模型组(M,n=72)和针刺组(A,n=72)；模型组和针刺组按造模成功后6 h、12 h、24 h和72 h分为4个亚组(n=18)。

1.2 ICH造模及模型成功标准

根据改良过的Rosenberg[6]方法制备大鼠脑出血模型。假手术组大鼠断尾，取血，微量注射器进针等操作与模型组相同，但不进行注血，进针后留针5 min。采用Zea Longa[7]5分制评分作为造模成功标准，1～3分表明造模成功。

1.3 干预方法

针刺组：大鼠按照《实验动物穴位图谱》选取百会穴、曲鬓穴。局部消毒后，手持针灸针(0.30 mm×25 mm)快速进针，并向右下方曲鬓穴透刺，进针深度15 mm，以200 r/min小幅度捻转。每间隔5 min捻针1次，每次持续捻转5 min，共留针30 min，每12 h针刺1次。

假手术和模型组：每天与针刺组相同时间点抓取1次，并固定30 min，不予以针刺。

1.4 神经功能评分

参照mNSS神经功能评分系统[8]对各时间点大鼠进行神经功能评分。

1.5 脑水含量测定

分别于造模后6 h、12 h、24 h、72 h将大鼠断头取脑，并分离左、右侧大脑半球。每部分分离后立即称重(湿重)，放置于105℃恒温干燥箱中干燥72 h后再次称重(干重)。脑水含量百分比计算公式为：[(湿重-干重)/湿重]×100%。

1.6 ELISA法检测IL-1β水平

大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg)，取腹主动脉血5 mL，室温静置20 min，用离心机以3 000 r/min的速度离心20 min，分离上层血清，-20℃冰箱冷冻备用。采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行IL-1β测定，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 Real-time PCR检测

按RNAiso Plus(Takara公司)说明书要求提取脑组织中的RNA。应用PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit，(Takara，D6210A)进行逆转录合成cDNA。引物序列如下：内参基因 β-actin : f:AACACCCCAGCCATGTACGTA;r:TGGCCATCTCTTGCTCGAA;目标基因IL-1β: f:AAGGGGACATTAGGCAGCAC;r:ATGAAAGACCTCAGTGCGGG。逆转录反应条件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min后，冰上冷却。用Takara,SYBR Premix Ex Taq kit进行RT-PCR。

Real time PCR 反应条件:95 ℃ 30 s;( 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s)×40循环,目的基因相对表达水平用2-△△Ct值表示[9]。

1.8 统计学处理

应用Graph Pad Prism6软件进行数据分析。各组结果应用单因素方差分析结合Tukey检验，P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分结果

如图1、表1所示，与假手术组相比,各时间点模型组评分显著升高(P<0.05)；与模型组相比,相同时间点针刺组评分明显降低(P<0.05)，但仍高于假手术组。

表1 各组大鼠神经功能评分结果

注：与假手术组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05

图1 各组神经功能评分结果注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.2 各组大鼠脑水含量检测结果

如图2、表2所示，与假手术组相比,各时间点模型组脑水含量显著升高(P<0.05)； 6 h、12 h时间点针刺组与模型组脑水含量无显著差异(P>0.05)；24 h、72 h时间点针刺组脑水含量较相同时间点模型组明显降低(P<0.05)，但仍高于假手术组(P<0.05)。

图2 各组脑水含量测定结果注：与假手术组比较，*P<0.05 ；与模型组比较，#P<0.05

2.3 各组大鼠ELISA结果比较

如图3、表3所示，与假手术组相比，各时间点模型组大鼠血清IL-1β水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,同一时间点针刺组IL-1β水平显著降低(P<0.05)，但仍高于假手术组(P<0.05)。

表2 各组大鼠脑水含量检测结果

注：与假手术组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05

表3 各组大鼠血清IL-1β含量测定结果

注：与假手术组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05

2.4 Real-time PCR结果

如图4、表4所示，与假手术组相比，各时间点模型组大鼠IL-1β mRNA水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,同一时间点针刺组IL-1β mRNA水平显著降低(P<0.05)。

表4 各组大鼠脑组织IL-1β mRNA相对含量

注：与假手术组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05

图3 各组血清IL-1β含量测定结果注：与假手术组比较，*P<0.05 ；与模型组比较， #P<0.05

图4 各组脑组织IL-1βmRNA相对含量注：与假手术组比较，*P<0.05 ；与模型组比较，#P<0.05

3 讨论

脑出血刚发生后，血液大量累积直接压迫周围脑组织，迅速发生一系列细胞和分子的病理过程。这种细胞和炎症的激活触发单核细胞浸润、小胶质细胞活化、血脑屏障的破坏以及脑水肿的发展，严重影响继发性脑损伤的损伤程度[9-11]。大鼠发生脑出血后血肿周围很快有白细胞浸润和小胶质细胞聚集。这些细胞吞噬清除坏死的脑组织,释放炎性细胞因子、蛋白酶、氧自由基等多种物质，杀伤神经元,参与迟发性神经元损伤[12]。IL-1β作为免疫反应的中央协调器和炎症反应的关键触发点[6]，是脑损伤的重要因素。不仅可以直接损伤神经细胞促进其凋亡,还增强黏附因子的表达,增加微血管通透性,引发脑水肿。IL-1β脑内注射可以导致血管源性脑水肿[13]。研究脑出血诱发的炎症反应和脑水肿的病理生理机制已成为治疗脑出血的潜在靶点。

针灸作为中国传统医学的重要组成部分，在降低中风患者致残率，促进神经功能恢复等方面的疗效显著，已在世界范围内得到了广泛的关注和认可[14-16]。虽然已有研究证实针灸在改善中风后神经系统炎症[15]，抑制细胞凋亡，缓解神经功能损伤[17]等方面疗效确切，但针灸治疗脑出血的有效性及作用机制仍有待进一步研究和发现。我们在前期的实验中发现，针刺“百会”透刺“曲鬓”可以通过促进脑出血急性期内源性GDNF表达，发挥神经重塑作用[18]；通过抑制Notch1 和 Hes1蛋白的表达促进神经干细胞的再生和修复[19]；也可通过调节自噬相关蛋白表达有效改善脑损伤[20]；并且通过抑制NF-κB经典通路，有效拮抗脑出血炎性脑损伤[16]。在该项实验中，我们通过对脑出血大鼠模型IL-1β水平检测及脑水含量的观察发现，针刺“百会”透“曲鬓”有效降低了ICH大鼠脑组织IL-1β mRNA及血清中IL-1β的水平，控制了脑水肿进展，改善了脑出血后神经功能障碍。

综上所述，针刺“百会”透“曲鬓”穴，通过降低脑出血大鼠IL-1β表达水平，起到抑制脑水肿，降低神经功能损伤的作用。

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