托吡酯对酸敏感离子通道1a调控作用的研究

李 雯， 魏 东

细胞外微环境pH值的改变对于神经细胞发挥正常的生理功能是非常重要的[1]。在炎症、缺血、创伤、退行性疾病以及癫痫发作等神经系统病理情况下，厌氧糖代谢造成的乳酸堆积和ATP水解等释放大量的H+使得组织内pH值极大地降低而出现组织酸化[2～9]，直接或间接导致神经元损伤及功能改变[10]。1997年，一种能够被酸化所激活的阳离子通道-酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)被发现之后[11]，大量的研究发现ASICs特别是其1a亚型(ASIC1a)广泛表达于中枢神经系统且在神经系统的生理和病理过程中发挥着重要的作用[12]，尤其是在癫痫的发生及发展领域，ASIC1a已经成为一个研究的热点。托吡酯(topiramate，TPM)作为选择性电压依赖的钠离子通道阻断剂，是否通过对ASICs的调节而发挥抗癫痫作用尚无研究报道，因此，我们采用全细胞记录膜片钳及Western blot定量分析TPM对ASICs介导电流的调控作用及对其蛋白表达的影响，来探讨ASICs是否是TPM抗癫痫治疗的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物：怀孕16～17 d的雌性SD大鼠(第四军医大学动物中心)；(2)实验细胞及质粒：CHO细胞及ASIC1a、ASIC2a及ASIC3 3种质粒(上海交大医学院徐天乐老师惠赠)；(3)主要试剂：F12培养基、L型谷氨酰胺等细胞培养相关试剂(美国GIBCO公司)，HilyMax质粒转染试剂(日本Dojindo Laboratiories公司)，BCA试剂盒(美国Pierce公司)，ASIC1a抗体(美国Milipore公司)，辣根过氧化物酶标记的二抗(美国Milipore公司)，GAPDGH抗体(美国CST公司)，Nacl、Kcl等电生理试剂(美国Sigma公司)。

1.2 胞系的培养及传代 CHO细胞培养在37 ℃、5% CO2孵育箱中内，采用F12培养基加入50 U/ml的青霉素、1 mmol/L L型谷氨酰胺、50 μg/ml的链霉素和10%的胎牛血清，观察细胞生长情况，每2～3 d半量换液。在无菌情况下传代，先吸弃原有培养基，PBS洗3遍，加入0.125%的胰蛋白酶消化2～3 min，然后加入含血清的F12培养基终止消化，将贴壁细胞吹打脱落，吹散后进行离心5 min(1000 r/min)，弃上清后，再加入适量培养基，充分吹打重悬，计数后进行接种备用。

1.3 大鼠皮质神经元原代培养 将怀孕16～17 d的雌性SD大鼠进行乙醚气体麻醉，剪开消毒过的腹壁并暴露子宫，取6～8个胚胎置于玻璃皿中。无菌的情况下从子宫中剖取胎鼠后夹取头部置于预冷过的DMEM溶液中，解剖显微镜下充分剥离脑膜，剥去大脑皮质以外的其它结构。将其剪碎后，加入0.05%胰蛋白酶于37 ℃、5% CO2孵育箱中消化约5 min，加入10%的胎牛血清高糖DMEM溶液终止消化，充分吹打后过滤、1000 r/min，5 min离心，弃上清后加入适量接种培养基充分吹打重悬，计数后进行接种备用。次日更换半量维持培养基(含2%的B27及1 mmol/L L型谷氨酰胺的Neural basal培养液)，以后根据细胞生长情况约2～3 d半量更换培养基。

1.4 细胞转染 培养的CHO细胞融合至70%～80%时进行脂质体转染，实验方案根据HilyMax liposome transfection reagent所提供的操作方法进行。在无菌情况下操作，每个60 mm培养皿加入约7～9 μg质粒；每个35 mm培养皿加入约3～4 μg质粒。转染4 h后吸弃含脂质体的培养基，PBS洗一次后更换为维持培养基；转染后的24～48 h内进行蛋白质提取以及电生理实验。当进行两种不同的质粒共转染时，采用相同的质粒量进行配比混合。

1.5 电生理记录 本实验电生理采用电压钳条件下的全细胞记录模式。配置电极内液及细胞外液的，玻璃微电极采用两步垂直拉制方法，使其入水电阻约为3.5～5.5 M。灌流给药采用“Y”管系统依靠重力实现[13]。实验时首先给予玻璃电极内施加正压，通过步进式微操仪将玻璃电极尖端轻压在细胞表面，撤除正压，使细胞膜吸附于电极尖端，给予串联电阻的自动补偿，逐渐给予负压吸引，施加-60 mV钳制电压，待形成超过G级别的巨阻抗后用负压将细胞膜吸破，使细胞内液与电极内液互通而形成全细胞记录。所记录信号通过放大器采集后通过数模转换器输入计算机，使用pCLAMP 9.0软件进行数据采集、设置调整，使用Clampex 9.0进行数据分析。

1.6 免疫印迹

1.6.1 样本制备 将神经元接种于60 mm培养皿中，培养6～7 d后给于TPM药物处理24 h，加入RIPA裂解液，冰上刮取细胞后进行冰上裂解15 min，收集裂解液置入EP管中，进行4 ℃低温离心(13000 r/min)20 min，收集上清，加入SDS上样缓冲液，金属浴(95 ℃)煮沸5 min，置于-80 ℃保存。

1.6.2 电泳、转模及免疫显色检测 首先制备SDS PAGE胶进行电泳，结束后用半干转膜法将蛋白样品从分离胶中转移至PVDF膜上，将PVDF膜在20%脱脂奶粉PBST溶液中室温封闭1 h，然后加入抗体稀释液配制的一抗(1∶1000)，4 ℃条件下旋转孵育过夜，加入稀释配制的二抗(1∶2000)，室温下孵育2 h，最后在暗室中进行ECL显色，使用X光胶片显影，胶片扫描后使用Image Pro Plus 6.1软件进行图像分析和数据采集。

2 结 果

2.1 TPM对不同ASIC亚单位的调控作用 根据神经系统ASICs的表达模式，在CHO细胞系上分别转染了ASIC1a、ASIC2a、ASIC1a+ASIC2a和ASIC3质粒，得到ASIC1a同聚体、ASIC2a同聚体、ASIC1a/ASIC2a异聚体和ASIC3同聚体通道。分别对这4种组合进行电生理记录并给予TPM(300 μM)(见图1)，发现不同亚单位组成的离子通道其所通透的内向电流曲线对TPM的反应不同，TPM仅对ASIC1a亚单位组成的同聚体通道有增强调控作用，而对另外3种通道均无明显的改变。

2.2 TPM对ASIC1a同聚体通道调节作用 TPM对ASIC1a同聚体通道介导的峰电流的增强效应也具有剂量依赖的特性，剂量越大，效应越大，最大可有近60%的增强效应，其半数有效剂量约为60 μM(见图2A)。这种增强效应与胞外酸化程度相关，100 μM的TPM可以增强18%左右pH 6.8诱导的峰电流强度，而在pH 6.0时则约为40%(见图2B)。随后我们采取了4种不同的TPM给药方式：仅与酸共给、仅预给10 s、仅预给10 min、先预给10 s然后与酸共给，发现必须在与酸共给的情况下才具有增强效应，而两种仅预给的方式都不能产生增强效应，这就提示TPM的作用具有通道状态依赖的特性，只有通道被打开后才能发挥作用(见图2C、D)。

2.3 TPM对ASIC1a蛋白的表达作用 我们给于原代培养的神经元不同浓度的TPM作用24 h后提取蛋白样品，通过Western blot定量分析，发现TPM并不影响ASIC1a的蛋白表达(见图3A、B)。

图1 托吡酯对不同ASICs通道内向电流的调控作用

(注：n>6，与给药前相比*P<0.05，NS表示无统计学差异)

图2 托吡酯对ASIC1a同聚体通道内向电流的调控作用

(注：n>6， 与给药前相比*P<0.05 ，NS表示无统计学差异)

图3 托吡酯对ASIC1a的蛋白表达的影响

(注：n=4，NS表示无统计学差异)

3 讨 论

酸敏感离子通道1a(acid-sensing ion channel 1a，ASIC1a)作为中枢神经系统内表达最广泛的ASICs家族成员之一，因其分布广泛、激活阈值较低并能通透钙离子而受到研究者的重视，当大脑皮质和海马神经元中ASIC1基因被敲除后，原来酸所激活的电流几乎被全部去除[14～16]，提示ASIC1a是中枢系统神经元中ASICs家族主要的功能性亚单位。大量的研究发现ASIC1a参与了体内众多的生理及病理过程。已经发现目前常用的各类药物中非甾体抗炎药[17]、麻醉剂利多卡因[18]以及治疗多发性硬化的药物4-氨基吡啶[19]对ASIC1a的功能具有调节作用，ASIC1a很可能作为这些药物的靶点参与了疾病的治疗过程之中。那么，托吡酯(topiramate，TPM)作为一种选择性阻断电压依赖的钠离子通道药物，在抗癫痫治疗的过程中是否也通过ASIC1a发挥作用的目前尚未报道，本实验通过全细胞记录模式及Western blot定量分析探讨了TPM对ASIC1a电流和蛋白表达的调控作用，目的在于确定ASICs是否是TPM治疗癫痫的可能作用靶点。

有研究发现ASIC1a非特异性抑制剂阿米洛利能够延长由锂-匹罗卡品诱导大鼠癫痫模型发作的潜伏期时间，提示ASIC1a可能是癫痫治疗的重要靶点，但ASIC1a参与癫痫发作终止的机制尚不明确。有文献报道癫痫发作后脑组织中出现明显的酸中毒，导致组织内环境pH值下降，继而激活了抑制性中枢神经元上ASIC1a通道，使癫痫发作终止[20]。也有研究者发现在小鼠的癫痫模型中干扰ASIC1a表达后，增加了小鼠癫痫发作的严重程度，而在ASIC1a过表达小鼠中出现了相反的结果，这提示可能是由于内环境的酸化激活ASIC1a而兴奋了抑制性中间神经元，从而终止了癫痫发作[21]。

本研究结果显示，TPM对ASIC1a同聚体通道产生的电流具有增强效应，而对ASICs家族其它3种亚型均无明显的影响，这种增强效应呈现剂量依赖的特性，随着药物浓度的增大，增强的强度也逐渐增大，同时与酸化的程度也呈正相关。那么TPM就有可能通过增强ASIC1a的电流而使抑制性的中间神经元兴奋，最终实现对癫痫发作的抑制。因此ASIC1a很可能是TPM抗癫痫作用的靶点之一。

癫痫发作和癫痫发生是两种不同的病理生理过程，我们的研究发现TPM对ASIC1a同聚体通道产生的电流具有增强效应而推论ASIC1a可能是TPM抑制癫痫发作的靶点之一，但在神经系统广泛表达的ASIC1a在癫痫发生的病理过程之中扮演什么样的角色，仍然是未知的领域，需要进一步的研究去探索和明确。

综上所述：我们发现TPM仅能增强ASICs家族中ASIC1a组成的同聚体通道所产生的内向电流，而对另外3种通道均无明显的调控作用；这种增强效应具有剂量依赖的特性，剂量越大，效应越大；并且必须在与酸共给的情况下才能发挥增强效应；TPM并不影响ASIC1a的蛋白表达。这提示ASIC1a可能是TPM抑制癫痫发作的作用靶点之一。

[1]Chesler M.The regulation and modulation of pH in the nervous system[J].Prog Neurobiol,1990,34(5):401-427.

[2]Chesler M.Regulation and modulation of pH in the brain[J].Physiol Rev,2003,83(4):1183-1221.

[3]Kraut JA,Madias NE.Metabolic acidosis:pathophysiology,diagnosis and management[J].Nat Rev Nephrol,2010,6(5):274-285.

[4]Sutherland SP,Cook SP,McCleskey EW.Chemical mediators of pain due to tissue damage and ischemia[J].Prog Brain Res,2000,129:21-38.

[5]Somjen GG.Acidification of interstitial fluid in hippocampal formation caused by seizures and by spreading depression[J].Brain Res,1984,311(1):186-188.

[6]Wang RI,Sonnenschein RR.PH of cerebral cortex during induced convulsions[J].J Neurophysiol,1955,18(2):130-137.

[7]Messier C,Gagnon M.Glucose regulation and cognitive functions:relation to Alzheimer’s disease and diabetes[J].Behav Brain Res,1996,75(1/2):1-11.

[8]Bowen BC,Block RE,Sanchez-Ramos J,et al.Proton MR spectroscopy of the brain in 14 patients with Parkinson disease[J].AJNR Am J Neuroradiol,1995,16(1):61-68.

[9]Koga K,Mori A,Ohashi S,et al.H MRS identifies lactate rise in the striatum of MPTP-treated C57BL/6 mice[J].Eur J Neurosci,2006,23(4):1077-1081.

[10]Chesler M,Kaila K.Modulation of pH by neuronal activity[J].Trends Neurosci,1992,15(10):396-402.

[11]Waldmann R,Champigny G,Bassilana F,et al.A proton-gated cation channel involved in acid-sensing[J].Nature,1997,386(6621):173-177.

[12]Wemmie JA,Price MP,Welsh MJ.Acid-sensing ion channels:advances,questions and therapeutic opportunities[J].Trends Neurosci,2006,29(10):578-586.

[13]Li WG,Liu MG,Deng SN,et al.ASIC1a regulates insular long-term depression and is required for the extinction of conditioned taste aversion[J].Nat Commun,2016,7(7):13770.

[14]Wemmie JA,Chen J,Askwith CC,et al.The acid-activated ion channel ASIC contributes to synaptic plasticity,learning,and memory[J].Neuron,2002,34(3):463-477.

[15]Xiong ZG,Zhu XM,Chu XP,et al.Neuroprotection in ischemia:blocking calcium-permeable acid-sensing ion channels[J].Cell,2004,118(6):687-698.

[16]Askwith CC,Wemmie JA,Price MP,et al.Acid-sensing ion channel 2 (ASIC2) modulates ASIC1 H+-activated currents in hippocampal neurons[J].J Biol Chem,2004,279(18):18296-18305.

[17]Voilley N,de Weille J,Mamet J,et al.Nonsteroid anti-inflammatory drugs inhibit both the activity and the inflammation-induced expression of acid-sensing ion channels in nociceptors[J].J Neurosci,2001,21(20):8026-8033.

[18]Lin J,Chu X,Maysami S,et al.Inhibition of acid sensing ion channel currents by lidocaine in cultured mouse cortical neurons[J].Anesth Analg,2011,112(4):977-981.

[19]Boiko N,Kucher V,Eaton BA,et al.Inhibition of neuronal degenerin/epithelial Na+channels by the multiple sclerosis drug 4-aminopyridine[J].J Biol Chem,2013,288(13):9418-9427.

[20]Ziemann AE,Schnizler MK,Albert GW,et al.Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a[J].Nat Neurosci,2008,11(7):816-822.

[21]Guo W,Chen X,He JJ,et al.Down-regulated expression of acid-sensing ion channel 1a in cortical lesions of patients with focal cortical dysplasia[J].J Mol Neurosci,2014,53(2):176-182.