热水提取沙棘多糖工艺研究

杨宏志，王洪江，张春芝，钟运翠，魏程程

（黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆 163319）

沙棘中富含100多种活性成分和营养物质，例如维生素、黄酮、甾醇、类脂和氨基酸等。这些营养物质具有重要的营养价值，主要分布在沙棘的果肉、果皮、叶片和种子中[1]。所以以沙棘为主的食品、保健产品的研制与生产目前也呈现出了向好的发展趋势。沙棘加工的常见副产品——沙棘果渣，往往由于缺乏精深加工导致其附加值降低，造成浪费。本试验以沙棘果渣为原料，试图提取果渣中的沙棘多糖，为更好的提取和利用沙棘多糖奠定基础。利用相似相溶的原理，用热水法提取得到沙棘果渣多糖可以在保证多糖提取率的同时更加有效的保留其中的有效活性成分[2]。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

沙棘果渣，含水率为6.44%，购于黑龙江大庆市场；葡萄糖，天津市大茂化学试剂厂提供；浓硫酸，齐齐哈尔市东大化工试剂厂提供；无水乙醇，沈阳市华东试剂厂提供；苯酚，北京市双翔达生化试剂仪器有限公司提供；丙三醇，天津市红岩化学试剂厂提供；氢氧化钠，哈尔滨市金丽化工试剂有限公司提供；3，5-二硝基水杨酸，湖州生物化学厂（上海）提供；蒸馏水，实验室自制。所有试剂均为分析纯。

1.2 试验仪器

DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥机，上海森信实验仪器有限公司产品；754紫外可见分光光度计，上海光谱有限公司产品；ALC-310.3型电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司产品；HWS24型电子恒温水浴箱，上海一恒科学仪器有限公司产品。

2 试验方法

2.1 沙棘多糖提取技术路线

将沙棘果渣经除杂后粉碎过40目筛，而后脱脂、脱单糖，过滤后经热风烘干得到沙棘果渣粉末，用热水法提取制得沙棘粗多糖，最后测沙棘粗多糖含量。

2.2 多糖含量的测定

参照苯酚-硫酸法[3]。浓硫酸可使多糖水解生成单糖与此同时迅速脱水形成糠醛衍生物，在苯酚的作用下生成有色的化合物。此种有色化合物在波长490 nm处有最大吸收，通过测定OD值可测得其含量。

取烘干至恒质量的葡萄糖0.010 0 g配制成100mL葡萄糖标准溶液，备用。

取葡萄糖标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL加蒸馏水至2.0 mL，而后加入1mL 5%的苯酚溶液，滴加浓硫酸5 mL，摇匀并于室温下放置0.5 h。用分光光度计在波长490 nm处测定OD值，做出标准曲线以得出回归方程。

按照标准曲线绘制的方法，吸取0.2 mL样液加蒸馏水至2.0 mL，加入1 mL 5%的苯酚溶液，滴加浓硫酸5mL，摇匀并于室温下放置0.5 h。以加入葡萄糖标准溶液0 mL为空白对照，用分光光度计在波长490 nm处测定OD值，代入回归方程求得样液的多糖含量。

2.3 还原糖含量的测定

采用3，5-二硝基水杨酸比色法[4]测定：将0.65 g的3，5-二硝基水杨酸，溶于5 mL蒸馏水中，置于100mL的容量瓶中，加入65mL 1mol/L的氢氧化钠溶液，再加入4.5 g甘油，摇匀后定容至100mL。制得3，5-二硝基水杨酸试剂。

比色法标曲的绘制：首先称量100mg葡萄糖标准品，然后添加蒸馏水稀释，配成1mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别量取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的葡萄糖标准溶液置于试管中，各试管中补加蒸馏水至1 mL，分别加入1 mL配制的DNS试剂，沸水浴（100℃）加热5 min，然后取出试管用自来水冷却至室温，再加入8mL蒸馏水，摇匀，测定吸光度（540 nm）。以葡萄糖的量为X轴，吸光度为Y轴，绘制标准曲线，得到回归方程。

样品含量的确定：取试样1mL放入试管中，加入1 mL的3，5-二硝基水杨酸试剂，于热水浴中反应5 min后，迅速冷却至室温加入8 mL蒸馏水，摇匀，于波长540 nm处测定其OD值，并根据标准曲线求得其还原糖的含量。

2.4 多糖提取得率的确定

多糖提取得率的计算方法参考了熊冰等人[5]的方法。

3 结果与讨论

3.1 标准曲线的绘制

（1）多糖含量的测定。根据前文所述，制得葡萄糖标准曲线（图1），标准曲线中回归方程的R2非常接近1，说明方程和曲线拟合度高。将样品于490nm处测得的OD值代入方程计算得到沙棘多糖含量 （μg）。

（2）还原糖含量的测定。将沙棘多糖样品用分光光度计在波长540 nm处测吸光度，由葡萄糖标准曲线（见图2） 方程计算可得到沙棘多糖还原糖得率。将样品测得的OD值代入回归方程计算沙棘多糖含量（μg）。相关系数非常接近1说明方程和曲线拟合好。

标准曲线（苯酚-硫酸法） 见图1，标准曲线（DNS法） 见图2。

图1 标准曲线（苯酚-硫酸法）

图2 标准曲线（DNS法）

3.2 单因素试验

固定试验温度为60℃，提取时间为40min，取料液比为 1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35进行热水法提取多糖单因素试验，而后测量OD值，计算得出多糖得率。用蒸馏水作为空白，每组测3个平行样。将计算所得出的结果绘制出多糖得率与料液比之间的关系图，多糖得率随料液比的变化。

料液比与多糖提取率的关系见图3。

图3 料液比与多糖提取率的关系

从图3可看出，当料液比为1∶25时多糖得率达到最大值，当料液比低于1∶25时，随着料液比的增大，多糖得率增大，当料液比从1∶20～1∶25时，多糖得率出现明显的“陡坡”式增大；而料液比继续增大时，多糖得率反而随着溶剂量的增大而减小[6]。出现此种情况极大地原因可能是，随着溶剂的增加，溶出物中除多糖外还含有其他物质，多糖与其相结合，从而使多糖的提取量下降。

固定料液比为1∶20，提取温度为60℃，选取提取时间20，40，60，80，100 min进行单因素试验，通过测定吸光度值，计算得出多糖得率。用蒸馏水作为空白，每组测3个平行样。根据所得数据绘制出多糖得率与提取时间的关系图，分析多糖得率随提取时间的变化规律。

时间与多糖提取率的关系见图4。

图4 时间与多糖提取率的关系

从图4可看出，当提取时间少于80 min时，随着提取时间的延长，多糖得率增大，当时提取时间从20min延长至40min时，多糖得率急剧增加。提取时间延长至40 min后，随着时间的延长多糖得率虽中间有略微下降但总体呈增加趋势。提取时间达到80 min时，多糖得率达到最大值。继续延长提取时间多糖得率反而下降[7-8]。出现此种情况极有可能是，提取时间过长导致水分蒸发量过多，沙棘果渣黏度增大，使得多糖的提取变得困难，从而使多糖的提取量减少[7]。

选取料液比为1∶20，提取时间为40min，取提取温度为50，60，70，80，90℃进行单因素试验，通过测定吸光度值，计算得出多糖得率。用蒸馏水作为空白，每组测3个平行样。将计算所得出的结果绘制出多糖得率与提取温度之间的关系图，多糖得率随提取温度的变化。

温度与多糖提取率的关系见图5。

从图5可看出，多糖提取量随着提取温度的增大而增加，提取温度为90℃时具有最大的多糖得率。但是考虑到多糖的生物活性与温度有很大的关系，温度过高会使得生物活性降低，所以选择温度为3个中间温度进行正交试验。

3.3 因素间互作效应试验

根据单因素试验的方法，在选定的3个因素中固定1个因素，选取另一因素的2个条件与其他一因素进行单因素试验并作图。

图5 温度与多糖提取率的关系

图6 料液比与温度的互作效应影响

料液比与温度的互作效应影响见图6，时间与料液比的互作效应影响见图7，时间与温度的互作效应影响见图8。

图7 时间与料液比的互作效应影响

图8 时间与温度的互作效应影响

从图6，图7可看出，料液比与温度之间、料液比与提取时间之间没有交互影响；但从图8中看出，温度与提取时间之间有比较弱的交互影响。

3.4 正交试验

试验因素与水平设计见表1，L9（34）试验方案及结果见表2。

表1 试验因素与水平设计

表2 L9（33）试验方案及结果

通过表2可以看出，3个因素的级差大小顺序为R3＞R2＞R1，说明上述3个因素对多糖得率的贡献影响从大到小顺序为C＞B＞A，即按照对多糖得率的影响来说温度＞料液比＞提取时间。因此热水法提取沙棘多糖最佳工艺条件组合为C3B1A1，即料液比为1∶25（g∶mL），提取温度为80℃，提取时间为40 min，经验证试验得到在此条件下沙棘果渣多糖提取率达到102.36mg/g。

4 结论

依据试验结果得出，用热水法提取沙棘果渣中的沙棘多糖的最佳提取工艺参数为料液比1∶25（g∶mL），温度80℃，提取时间40 min。在此工艺条件下沙棘粗多糖提取率可达102.36 mg/g，其多糖提取率显著高于微波、超声等其他提取方法。热水法提取耗时长、耗能高的缺点是今后要进一步解决的问题。

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