B型肉毒毒素轻链的高效制备及活性鉴定

罗森，陈芳红，李涛，王慧

1.遵义医药高等专科学校，贵州 遵义 563002；

2.军事医学科学院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071

肉毒毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）是由肉毒梭状芽孢杆菌在厌氧环境中产生的外毒素，是目前毒性最强的一种生物毒素，对人的致死量约为0.1 μg。根据其抗原性的不同，可将肉毒毒素分为A～G共7个血清型，人类的肉毒中毒主要由A、B和E型引起[1]。肉毒毒素是相对分子质量（Mr）约为150 000的蛋白质，由一条Mr约50 000的轻链（LC）和一条Mr约100 000的重链（HC）通过二硫键联结在一起，具有锌离子依赖的催化活性结构域位于毒素的LC中[2-3]。肉毒毒素的致病机制是由HC结合到后胆碱神经能细胞并易位通过细胞膜进入神经细胞释放出LC[4-6]。LC作为一种锌内肽酶，选择性切割神经细胞内底物SNARE蛋白。每个血清型的轻链都切割特异的底物蛋白，其中B型肉毒毒素特异性裂解SNARE蛋白中VAMP-2的Q76-F77位点[7-9]，从而阻断神经递质乙酰胆碱的释放，引起肌肉松弛麻痹、呼吸肌麻痹，甚至导致人畜中毒死亡。在我国许多省区，时有A型和B型肉毒中毒发生[10-14]。

由于肉毒毒素具有剧毒性，稳定性差，其操作面临潜在的健康危害甚至生命危险。为了避免这些问题，并能够经济高效地得到有活性的稳定的肉毒毒素LC，作为试剂应用于肉毒毒素酶类抑制剂高通量检测方法的研究，食品卫生、进出口检疫检验，以及对美容医疗用肉毒毒素活性分析和检测，我们通过基因克隆技术，从B型肉毒梭菌中调取BoNT/B LC基因，在大肠杆菌中重组表达，通过SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定，亲和纯化后，利用底物与BoNT/B的催化活性做对比分析了重组蛋白。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌 DH5α、BL21（DE3）Rosetta感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；表达质粒pET-22b由本室保存；B型肉毒梭菌和BoNT/B由本室制备保存；底物CYB［CFP-VAMP（33-94）-YFP］[15]由本室制备保存；DNA标志物、蛋白质相对分子质量标志物、质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；限制性内切酶XhoⅠ和NdeⅠ购自New England Biolabs公司；培养基为LB培养基；IPTG购自Promega公司；引物及基因测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；HisTrap FF柱（5 mL）购自GE Healthcare公司。

1.2 引物设计与合成

根据B型肉毒毒素序列（GanBank：M81186.1）中的LC片段及载体序列，设计和合成上游引物P3（5′-CATATGCCAGTTACAATAAATAATTTT-3′）和 下游 引物 P4（5′-CTCGAGTTTAACACTTTTACA CATT-3′），分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点（下划线部分）。

1.3 目的基因的克隆和原核表达载体pET-22b-BoNT/B LC的构建与鉴定

厌氧培养B型肉毒梭菌后离心收集菌体，用50 μL 0.01 mol/L Tris-HCl（pH7.4）重 悬 ，加 入50 μL 0.5 mol/L KOH，96℃加热 10 min，加入100 μL 0.5 mol/L Tris-HCl（pH6.5），12 000 r/min离心10 min，取上清10 μL作为模板进行PCR扩增。25 μL PCR扩增体系包括H2O 17.5 μL，缓冲液 2.5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，Taq酶 1 μL，模板 1 μL。PCR 扩增反应条件：95℃ 3min；94℃ 30 s，53℃40 s，72℃ 1.5min，30次 循 环 ；72℃ 延 伸 10 min。用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物后连接T载体，转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定的阳性重组质粒用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，回收BoNT/B LC片段，与经同样双酶切处理的pET-22b载体用T4DNA连接酶连接，构建原核表达载体pET-22b-BoNT/B LC，转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性菌落提取质粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序鉴定。

1.4 重组蛋白BoNT/B LC的诱导表达

将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）Rosetta感受态细胞，挑选阳性菌落接种于含氨苄西林（Amp）（100 mg/L）的 LB培养基中，37℃过夜振荡培养，按1∶100的比例转接于3 L三角烧瓶中扩大培养，待菌体D600nm为0.8左右，加入IPTG至1 mmol/L，调节温度为20℃继续诱导培养20 h，诱导结束后4℃、6000 r/min离心5 min收集沉淀菌体，用结合缓冲液（A液）重悬，放置冰上进行超声波破碎处理，4℃、12 000 r/min离心10 min，SDS-PAGE分析上清和沉淀中的目的蛋白。

1.5 重组蛋白BoNT/B LC的纯化

取细菌培养液，4℃、6000 r/min离心收集菌体，菌体沉淀重悬于结合缓冲液（20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L NaCl，40 mmol/L 咪唑，pH7），超声波破碎处理后取上清，用HisTrap FF柱上样，用10个柱床体积的结合缓冲液平衡柱，然后用洗脱缓冲液（20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH7.4）线性梯度洗脱，收集洗脱样品用SDS-PAGE分析，采用Bradford法对纯化产物定量，纯化后的重组蛋白透析于缓冲液（50 mmol/L HEPES，pH7.5）中，保存于-20℃备用。

1.6 重组蛋白BoNT/B LC的活性和稳定性检测

重组蛋白BoNT/B LC与CYB在反应液（50 mmol/L HEPES，2.5 mmol/LDTT，10 μmol/L Zn⁃Cl2，pH7.4）中于 37℃反应 30 min，同时设定一组不加BoNT/B LC的阴性对照和一组加BoNT/B全毒素的阳性对照。经20%SDS-PAGE后考马斯亮蓝显色检测切割情况，分析BoNT/B LC的活性。用 BoNT/B LC（10 nmol/L）切割 2～100 μmol/L不同浓度的CYB，切割反应时间为20 min，加入SDS-PAGE上样缓冲液终止反应，SDS-PAGE检测，对电泳图用Chemi Doc XRS成像系统（Bio-Rad）光密度分析法测定，由CYB蛋白切割和未切割的百分比计算得到动力学参数。将纯化蛋白分别保存于23℃、4℃和-20℃，每10 d检测一次重组蛋白的活性和自身降解情况。

2 结果

2.1 BoNT/B LC的基因克隆和表达质粒构建

图1A为通过PCR扩增获得的BoNT/B LC基因片段，预期大小为1326 bp，与电泳结果相符。测序结果表明扩增产物与GenBank中报道的基因序列一致性为99%。图1B显示NdeⅠ和XhoⅠ双酶切pET-22b-BoNT/B LC后的产物，切割产物大小与PCR结果一致，提示目的基因正确插入pET-bn22b表达载体中。

2.2 重组蛋白BoNT/B LC在大肠杆菌中的诱导表达与纯化

pET-22b-BoNT/B LC质粒转化表达菌株BL21 Rosetta感受态细胞，在IPTG诱导下表达，SDS-PAGE分析显示，与未诱导菌相比，诱导菌上清在Mr约50 000处有诱导表达的蛋白带，与预期大小相符（图2），表明目的蛋白为可溶性表达。分析发现目的蛋白的表达量占细菌总蛋白的30%左右，经SDS-PAGE分析，通过HisTrap FF柱纯化的蛋白在Mr约50 000处有一条单一的蛋白带，与预期大小相符，纯度在95%以上，提示得到较高纯度的目的蛋白（图3）。

2.3 重组蛋白BoNT/B LC的活性检测和稳定性检测

BoNT/B LC可特异性识别裂解其底物VAMP-2蛋白的 Q76-F77[20]。将不同浓度（1、2、10 nmol/L）的BoNT/B和纯化制备得到的蛋白分别与CYB在反应液中于37℃孵育30 min，SDS-PAGE分析反应结果如图4。与BoNT/B一样，制备的蛋白能酶解CYB后产生与预期相符的2条蛋白片段，表明制备得到的蛋白即为重组蛋白BoNT/B LC。动力学参数测定结果表明，BoNT/B LC酶解CYB 的Km和kcat值分别为 17.6±2.6 μmol/L 和4.16±0.28/s，而BoNT/B酶解CYB的Km和kcat值分别为15.9±2.4 μmol/L 和 1.43±0.72/s。

图1 BoNT/B LC PCR产物（A）和pET-22b-BoNT/B LC表达载体（B）的鉴定

图2 目的蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）Rosetta中的表达

稳定性检测结果显示：BoNT/B LC透析于缓冲液（50 mmol/L HEPES，pH7.5）中，于 23℃条件下保存30 d具有85%的酶活性，4℃保存30 d具有100%的酶活性。

图3 纯化后重组目的蛋白的检测

图4 SDS-PAGE分析目的蛋白和BoNT/B与CYB的反应结果

3 讨论

由于肉毒毒素是剧毒物质，对其操作面临潜在的危险，同时还无法从天然的肉毒毒素中有效分离HC和LC片段。LC已被证实是治疗肉毒毒素中毒的关键药靶，开发高效BoNT LC抑制剂是当前研究的热点领域[16-19]。在基于肉毒毒素活性的分析方法中，小鼠生物检测仍是目前惟一被公认的确认BoNT的方法[20]。但小鼠生物检测本身也有缺点，如检测成本较高、检测需4 d时间、检测过程中可能有非特异性死亡、对大批量的样本进行检测存在困难等。针对BoNT LC抑制剂开发的大量样本的初步筛选，建立高通量的体外检测方法，能够极大地减少检测时间和工作量。本研究的目的是利用基因工程手段高效制备BoNT/B LC重组蛋白，为后续的BoNT LC抑制剂高通量体外检测方法的测试研究奠定基础。

对于BoNT/B LC的纯化制备，与Gilsdorf[21]等曾采用阳离子交换色谱法不同，我们通过在重组蛋白的C端加上组氨酸标签，利用HisTrap FF柱进行亲和纯化，通过一次过柱纯化得到高纯度的目的蛋白，纯化方法简单容易。与曾有研究报道的BoNT/B LC的原核表达及纯化相比，为了提高目标蛋白的表达产量，选择携带稀有密码子的表达菌株大肠杆菌 BL21 Rosetta，比 BL21（DE3）菌株的表达量提高约2倍，目的蛋白的表达量达细菌总蛋白的30%左右；采用20℃低温诱导并延长诱导时间，比37℃诱导的表达量提高5倍以上，且包涵体更少，可能是由于低温条件更有利于该蛋白的表达和正确折叠，表达的目的蛋白绝大部分存在于菌体裂解液上清中。酶活分析证明所制备的重组蛋白LC的酶活性略高于全毒素，这可能是由于全毒素中LC的活性部位被包围在HC的易位域带中，而单独的LC与全毒素中的LC相比可暴露更多的活性位点。类似结果在BoNT/A LC中也有报道[22-23]。

本研究获得的BoNT/B LC重组蛋白具有高活性、高稳定性，制备高效，安全无毒，为后续BoNT/B LC抑制剂高通量体外检测方法的研究和BoNT/B LC抑制剂的筛选奠定了基础。

[1] Sollner T,Whiteheart S W,Brunner M,et al.SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion[J].Nature,1993,362(6418):318-324.

[2] Poulain B,Mochida S,Weller U,et al.Heterologous combinations of heavy and light chains from botuli⁃num neurotoxin A and tetanus toxin inhibit neurotrans⁃mitter release in Aplysia[J].J Biol Chem,1991,266(15):9580-9585.

[3] Black J D,Dolly J O.Interaction of125I-labeled botuli⁃num neurotoxins with nerve terminals.II.Autoradio⁃graphic evidence for its uptake into motor nerves by acceptor-mediated endocytosis[J].Cell Biol,1986,103(2):535-544.

[4] Shone C C,Hambleton P,Melling J.A 50-kDa frag⁃ment from the NH2-terminus of the heavy subunit of Clostridium botulinum type A neurotoxin forms chan⁃nels in lipid vesicles[J].Eur J Biochem,1987,167(1):175-180.

[5] Montal M S,Blewitt R,Tomich J M,et al.Identifica⁃tion of an ion channel-forming motif in the primary structure of tetanus and botulinum neurotoxins[J].FEBS Lett,1992,313(1):12-18.

[6] Schmid M F,Robinson J P,DasGupta B R.Direct vi⁃sualization of botulinum neurotoxin-induced channels in phospholipid vesicles[J].Nature,1993,364(6440):827-830.

[7] Montecucco C,Schiavo G.Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins[J].Q Rev Biophys,1995,28(4):423-472.

[8] Foran P,Shone C C,Dolly J O.Differences in the protease activities of tetanus and botulinum B toxins revealed by the cleavage of vesicle-associated mem⁃brane protein and various sized fragments[J].Biochem⁃istry,1994,33(51):15365-15374.

[9] Chen S,Hall C,Barbieri J T.Substrate recognition of VAMP-2 by botulinum neurotoxin B and tetanus neu⁃rotoxin[J].J Biol Chem,2008,283(30):21153-21159.

[10]羊立山.肉毒中毒10例临床分析[J].宁夏医学院学报,2000,22(3):198-199.

[11]于丽.肉毒中毒28例临床分析[J].武警医学,2003,14(12):734.

[12]樊奇,李欣,尚金凤,等.三起肉毒中毒案例报告[J].地方病通报,1999,14(4):114-115.

[13]张芳,潘立,连西兰,等.一起肉毒毒素引起食物中毒的报告[J].中国卫生检验杂志,2003,13(6):773-774.

[14]李伟,陈浩.一起食用自制臭豆腐引起的肉毒毒素中毒报告[J].职业与健康,2004,20(3):50-59.

[15]Ruge D R,Dunning F M,Piazza T M,et al.Detec⁃tion of six serotypes of botulinum neurotoxin using flu⁃orogenic reporters[J].Anal Biochem,2011,411(2):200-209.

[16]Benagiano V,Lorusso L,Flace P,et al.VAMP-2,SNAP-25A/B and syntaxin-1 in glutamatergic and GA⁃BAergic synapses of the rat cerebellar cortex[J].BMC Neurosci,2011,12:118.

[17]Li B,Pai R,Cardinale S C,et al.Synthesis and bio⁃logical evaluation of botulinum neurot oxin A protease inhibitors[J].Med Chem,2010,53:2264-2276.

[18]Cardinale S C，Butler M M，Ruthel G，et al.Novel benzimidazole inhibitors of botulinum neurotoxin/A dis⁃play enzyme and cell based potency[J].Botulinum J,2011,2(1):16-29.

[19]Park J B,Simpson L L.Progress toward development of an inhalation vaccine against botulinum toxin[J].Ex⁃pert Rev Vaccines,2004,3:477-487.

[20]Lindström M,Korkeala H.Laboratory diagnostics of botulism[J].Clin Microbiol Rev,2006,19(2):298-314.

[21]Gilsdorf J,Gul N,Smith L A.Expression,purifica⁃tion,and characterization ofClostridium botulinum type B light chain[J].Protein Expr Purif,2006,46(2):256-267.

[22]Ahmed S A,Byrne M P,Jensen M,et al.Enzymatic autocatalysis of botulinum A neurotoxin light chain[J].Protein Chem,2001,20:221-231.

[23]罗森,齐芬芳,宫路路,等.A型肉毒毒素轻链的原核表达、纯化及活性鉴定[J].生物技术通讯,2015,26(5):632-635.