抗炭疽人源化单抗在炭疽芽孢致死小鼠模型中的治疗效力评价

张端阳，李建民，刘威岑，付广成，陈薇

军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的人畜共患的烈性传染病。按照感染途径不同，可以分为皮肤炭疽、胃肠炭疽、肺炭疽和注射炭疽4种[1]，其中肺炭疽的致死率高达90%[2]，其芽孢还是一种潜在的生物战剂和生物恐怖袭击的武器。炭疽芽孢杆菌的毒力因子包括2个方面，即聚-D-谷氨酸荚膜和炭疽毒素。其中荚膜能够阻止细菌被吞噬细胞吞噬，毒素则包括护性抗原（protective antigen，PA）、致死因子（lethal factor，LF）和水肿因子（edema fator，EF）3种蛋白。单一的蛋白质均不能发挥作用，致死因子或水肿因子需要和保护性抗原结合成致死毒素（LF+PA；lethal toxin，LT）或水肿毒素（EF+PA；edema toxin，ET）才能发挥毒性作用。LT和ET在感染初期均能损伤先天免疫系统；而在感染后期，已有研究显示LT和ET能够分别破坏心血管系统和消化系统，造成不可逆的损伤及宿主死亡[3]。

现阶段的治疗策略主要有抗生素和治疗性抗体2种。抗生素种类较多，一般联合使用，能够有效对抗敏感的炭疽芽孢杆菌，但不能清除体内的炭疽毒素。而治疗性抗体不仅对炭疽芽孢杆菌有效，而且能够有效中和炭疽毒素，降低毒素对宿主造成的损伤，提高存活率。目前国外研究获得的炭疽毒素抗体主要是抗PA抗体[4]，已有2种抗PA单抗（Abthrax和Anthim）获得美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于吸入性炭疽的治疗[5-6]。5E11是本研究室前期研究获得的抗PA人源化单抗，亲和力达到6.63 nmol/L，已经在细胞模型和毒素攻击大鼠模型中显示出良好的保护效果[7]，因而也需要更多的动物模型进一步评价5E11的治疗效力。在炭疽动物模型中，使用强毒株的芽孢攻毒最接近真实感染的情况，但这种实验即使在规定的生物安全三级实验室（BSL-3）中进行仍然具有很高的安全风险。而已有报道显示，荚膜缺失的弱毒株（Sterne株）能够致死DBA/2J小鼠[8]，据此我们用同样缺失荚膜的疫苗株A16R对DBA/2J小鼠攻毒，发现同样具有致死能力。进一步地，我们用不同剂量的芽孢对小鼠攻毒，计算出半数致死剂量（LD50），并用该模型评价单抗5E11的治疗效力。

1 材料和方法

1.1 材料

6～8周龄雌性DBA/2J小鼠购自南京大学模式动物研究所；炭疽疫苗株A16R由本研究室保存；5E11单抗由中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，经纯化后蛋白纯度可达99%；重组炭疽保护性抗原（rPA）、致死因子（rLF）、水肿因子（rEF）均使用大肠杆菌BL21(DE3)表达，经纯化后蛋白纯度可达到95%以上；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人二抗和HRP标记的羊抗小鼠二抗均购自Ab⁃cam公司；化学发光显色液购自Solarbio公司。

1.2 A16R半数致死剂量测定

将37只DBA/2J雌性小鼠分成6组，前5组每组6只，第6组7只，各组依次用不同剂量（103～105CFU）的A16R芽孢在小鼠背部皮下注射攻毒，之后每天至少观察一次，连续观察14 d，采用Bliss法计算A16R芽孢的LD50。

1.3 5E11在DBA/2J小鼠体内的药代动力学参数测定

将15只DBA/2J雌性小鼠分成3组，每组5只，根据小鼠体重通过尾静脉分别注射40、10和2.5 mg/kg的 5E11，在给药后 0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h、48 h、72 h、6 d、9 d、12 d、18 d、24 d、30 d采血，并采用 ELISA法测出血清中5E11的浓度，进而计算得到5E11在DBA/2J小鼠体内的药代动力学参数。

1.4 5E11治疗实验

将50只DBA/2J雌性小鼠分成10组，每组5只，在第0 d用100倍LD50对50只小鼠攻毒（经背部皮下注射A16R芽孢），在攻毒后第1、2、3 d，每天对其中3组小鼠通过尾静脉按体重分别注射40、10和 2.5 mg/kg的5E11；第 10组为对照组，在攻毒后1 h注射等体积辅料。之后持续观察14 d，观察小鼠存活等情况。14 d后，对存活的小鼠采血，ELISA检测小鼠血清中抗PA、LF和EF的鼠多抗滴度，作为对A16R产生毒素的验证。

1.5 ELISA实验

在5E11的药代动力学参数测定中，用纯化的2 μg/mL rPA包被酶标板，4℃过夜；用PBST洗涤3次，每次5 min；用2%牛血清白蛋白（BSA）于37℃封闭1 h；洗涤后加入PBS稀释后的小鼠血清样品或5E11（用于绘制标准曲线），于37℃孵育1 h；洗涤后加入HRP羊抗人二抗（1∶20 000稀释），37℃孵育1 h；洗涤，加入显色液，室温显色5 min，加终止液终止反应，最后在酶标仪上检测D450nm值。在5E11治疗实验鼠多抗的检测中，在不同的酶标板上分别用纯化的2 μg/mL的rPA、rLF和rEF包被，4℃过夜;用PBST洗涤3次，每次5 min；用2%BSA于37℃封闭1 h；洗涤后加入PBS稀释后的小鼠血清样品并梯度稀释，于37℃孵育1 h；洗涤后加入HRP羊抗鼠二抗（1∶20 000稀释），37℃孵育1 h；洗涤，加入显色液，室温显色5 min，加终止液终止反应，最后在酶标仪上检测D450nm值。

1.6 统计分析

采用GraphPad Prism 6软件进行统计分析；采用Bliss法计算LD50；对于LD50测定和5E11治疗实验，绘制Kaplan-Meier生存曲线并用log-rank检验进行分析；采用Phoenix WinNonlin 6.1软件计算5E11在小鼠体内的药代动力学参数。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A16R半数致死剂量

从图1可见，芽孢攻毒剂量为103～105CFU时，随着攻毒剂量的提高，小鼠的存活率整体上呈下降趋势。攻毒剂量为1×103CFU，小鼠存活率100%；当攻毒剂量达到2.4×105CFU时，小鼠全部死亡，死亡时间集中在4～5 d之间。用Bliss法计算得到的LD50约为7.8×103CFU。

2.2 5E11药代动力学参数

3组小鼠经尾静脉分别注射40、10和2.5 mg/kg的5E11后，根据ELISA测出的各时间点小鼠血清中的抗体浓度，计算得到的药代动力学参数见表1。比较3组ELISA结果，随着给药剂量的提高，血清中抗体的浓度近似成比例上升。40、10和2.5 mg/kg的5E11在小鼠体内的平均半衰期分别为168、201和176 h。

2.3 5E11药效学结果

攻毒后用5E11治疗的生存曲线如图2所示，攻毒后1 d给药的3个组均100%存活，表明3个给药剂量均能提供完全保护，与对照组存在显著性差异（P=0.0023）。攻毒后第2和3 d的给药组生存率为40%～80%，同一天给药的3个组中小鼠的存活率没有明显的剂量依赖性。对照组全部死亡，死亡时间为4～5 d。对于攻毒14 d后存活的小鼠，采血检测抗炭疽毒素多抗滴度，不同时间给药的3个高剂量组结果见表2，3个组抗PA和抗LF的多抗滴度均为103～104量级，表明A16R菌株在感染宿主过程中确实产生了毒素并激起了小鼠的体液免疫应答。抗EF多抗滴度最高只到102量级，推测可能是炭疽杆菌产生EF较少，也有可能是EF免疫原性较低所致。

图1 A16R芽孢攻击小鼠模型生存曲线

表1 5E11在DBA/2J小鼠体内药代动力学参数（x±s）

图2 5E11治疗给药生存曲线

表2 存活小鼠抗炭疽毒素多抗滴度几何均值

3 讨论

目前治疗吸入性炭疽还是以抗生素为主，国内尚未批准可用于治疗吸入性炭疽的单克隆抗体。本研究室前期研究获得的抗炭疽PA单抗5E11是一株高亲和力中和单抗，已在细胞和大鼠模型中表现出良好的中和能力[7]。本研究使用炭疽疫苗株A16R攻毒DBA/2J小鼠建立致死模型，并用该模型评价了5E11的效力，结果表明5E11具有良好的保护效果。

在建模部分，我们用多个不同剂量的A16R芽孢攻击小鼠，通过Bliss法计算得到的LD50为7.8×103CFU。而后我们通过ELISA实验测出了5E11在小鼠体内的药代动力学参数，其平均半衰期为7～8 d。在药效学部分，我们根据已建立的致死模型，用100倍LD50的A16R芽孢攻击小鼠，之后的第1、2、3 d，每天对其中3组注射几种不同剂量的5E11，结果显示攻毒后1 d给药的几个剂量组均能完全保护，攻毒后2～3 d给药能达到40%～80%的保护效力，说明攻毒后给药时间影响治疗效果，越早越好，而不同的给药剂量差别不大。对于存活小鼠进行的抗炭疽毒素多抗滴度检测，验证了A16R菌株在感染小鼠过程中确实产生毒素，并可激起小鼠体液免疫应答。

综上所述，炭疽疫苗株A16R攻毒DBA/2J小鼠模型可用于评价抗炭疽单抗治疗效力，5E11在芽孢攻击小鼠致死模型中表现出良好的保护效果，具有紧急治疗炭疽芽孢感染导致的急性炭疽的潜力。

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