一种带磁力搅拌的免疫散射比浊仪的设计

杨延丽，潘 峰

(1. 厦门安防科技职业学院 福建厦门361026；2. 桂林长海发展有限责任公司 广西桂林541001)

0 引 言

C反应蛋白(CRP)是一种急性时相反应蛋白，在急性和慢性感染、创伤、肿瘤、心肌梗塞时其血浓度急剧升高，检测 CRP对临床诊断有重要的参考价值[1]。目前我国临床试验测定 CRP特定蛋白的方法主要有两种，透射比浊法和散射比浊法。在大型全自动生化分析仪器中常用的是透射比浊法，但是生化仪受其方法学的制约只能检测到分子量大的蛋白，如免疫球蛋白和白蛋白。而临床上需要了解的恰恰是分子量精确到 ng/mL或 pg/mL级别的蛋白含量。对于门诊临床快速诊断的要求而言，研制便携式、小体积、快速检测的特定蛋白免疫检测仪器是非常必要的。这种专门的特定蛋白仪采用免疫散射比浊法，它可以将灵敏度提高到 ng/mL级别，从而增加了很多具有独特临床价值的蛋白检测项目。

此外，为了适应门诊临床诊断的简便、快速检测需求，最新的CPR试剂通常采用全血进行测试，省去了血清分离的处理过程，这对分析仪提出了更高的要求。为了适应这种需求，本设计研制的特定蛋白分析仪器采用免疫比浊检测方法，利用自动化的搅拌功能，将病人全血与试剂充分混合，使免疫反应中抗体抗原的结合更加充分。本仪器是一种将液相内的沉淀反应、现代光学检测技术和自动分析技术相结合的特定蛋白分析仪器，不仅可以检验 CRP，也可以测量免疫球蛋白、糖化血红蛋白等。

1 总体设计方案

根据免疫散射比浊检测法原理，结合特定蛋白检测试剂，针对全血检验的需求，本仪器总体框图如图 1所示。仪器由嵌入式处理器、光学装置、硅光电二极管、放大电路、A/D转换电路、恒温装置、比色杯检测传感器、试剂IC卡读卡器、微型打印机、USB接口、带触摸屏的显示模块、电源等模块组成。

图1 仪器总体框图Fig.1 Block diagram of the instrument

根据本仪器所使用的试剂特性，其主要的散射光是前向散射，故本仪器采集前向角为15～25 °的前向散射光，采用两级透镜将搜集到的散射光聚焦，最后将光线投射到硅光电二极管上。光路设计如图 2所示。

图2 光路设计示意图Fig.2 Schematic of optical path design

2 比浊仪硬件设计

为了使仪器获得较高的灵敏度和效率，光源与光电转换器件的响应频谱范围做良好的匹配是很重要的。根据试剂颗粒的尺寸，本仪器选用 LD红光点状激光器作为光源，激光器输出波长为 650,nm，最小光斑直径为φ0.3,mm，输出功率为 200,mW，光束发散度小，具备一致性好、稳定可靠性高的优点。光电转换传感器采用日本滨松的硅光电二极管 BPW69A，感光面积 5.8,mm×5.8,mm，峰值波长 660,nm，光谱响应范围 190～1,050,nm，较低的暗电流(小于200,pA)，较高的响应速度，较高的稳定性。

在比色杯孔底座下，各设计一套恒温装置，包括PTC加热片，DS18B20数字温度传感器，仪器开机后嵌入式处理器控制电路开启加热片加热，由DS18B20实时检测温度，使温度保持在接近人体温度的 35～37,℃范围内，用于给比色杯内的反应液加温。

在仪器的两个比色杯位置下面，各设计了一套直流电机+磁铁装置，当传感器检测到有比色杯插入测试孔时，自动启动磁力控制电机，仪器嵌入式处理器控制电磁铁转动，带动比色杯内的搅拌子快速搅拌反应液，促进全血中特定蛋白与试剂的免疫反应。

高灵敏度的硅光电二极管将接收到的散射光转换成电流信号，再由OPA121运放对电流信号进行放大，放大后的信号送入A/D转换芯片ADS1253转换成数字信号后，由嵌入式处理器接收并存储。

嵌入式处理器选用成熟的 ARM32芯片STM32F407，用于仪器的多任务处理：检测比色杯插入取出状态、控制恒温装置、控制磁力搅拌装置、控制LED光源、读取A/D转换数据、与试剂管理IC卡通信、接收触摸屏信息、控制显示屏模组、与 PC通信、将相关信息和结果保存打印等。

3 比浊仪软件设计

仪器的软件设计包括嵌入式处理器内的软件和上位机 PC软件。嵌入式处理器软件实现整机管理，采用 freeRTOS嵌入式操作系统管理所有任务，相对于单片机系统而言，该软件系统效率高，能够有序处理彩色液晶屏幕刷新、触摸屏输入、恒温控制、磁力搅拌、试剂 IC卡管理、与 PC通讯、打印输出等任务。上位机 PC的软件主要完成曲线拟合、与医院管理系统联机、临床检验相关数据管理等功能。其中比较重要的部分是利用测试得到的吸光值，去计算被测反应液中待测物含量的功能。

在免疫比浊法的抗原和抗体结合的过程中，吸光度与浓度之间不呈线性关系，通常情况是三次方程曲线关系。免疫比浊法在实际操作中，根据所用的终点法或速率法，用五点或七点不同浓度进行定标，经过三次曲线方程拟合求出一条能真实反映实际浓度与吸光度关系的曲线方程，作为定量的工作曲线。如果采用以往单一标准浓度单点定标方法，以及采用两点定标方法，误差较大，尤其是高值浓度范围内，测定结果与实际偏差太大。所以简单地采用线性拟合的方式处理免疫比浊数据，只能适用于浓度很低的情况。如果采用五点定标的方式，使用 logit-log函数拟合曲线[2]，拟合曲线的精度用相关系数(或称决定系数)R2的大小来判定[3]，只要相关指数 R2的值控制在0.99以上，则可以得到精确的拟合度、较高的准确性和较小的误差。

为了去除干扰信号以及本底的影响，本仪器测试前先用空比色杯测试一次光值，然后以实际测试比色杯反应液的光值减去空杯光值的方法扣除本底。在测试比色杯反应液光值时，每隔 10,s测试一次数值，一共测试12次，然后将12次数据求平均值，提高测试结果的准确性。因为被测物含量与反应液中抗体抗原结合物浓度有关，结合物的浓度与硅光电二极管所测得的散射光强度有关，本仪器将硅光电二极管测得电流转换成电压，经过高性能运动放大转换成数字信号后，仪器将该信号传送到PC机，PC机根据五点定标 logit-log函数计算出参数，用确定参数的logistic4P方程计算待测物的浓度。PC机将待测物浓度数据回传给仪器的嵌入式处理器，再结合所用试剂类型、试剂批号、测试时间等信息，生成免疫比浊检验报告，通过微型热敏打印机打印出来作为诊断依据。

为了检验本仪器测试特定蛋白指标的准确性，将一组 10个已知浓度的测试液(3.01,μg/mL、3.23,μg/mL、6.57,μg/mL、8.73,μg/mL、16.79,μg/mL、18.39,μg/mL、 46.83,μg/mL、 57.09,μg/mL、130.76,μg/mL、141.18,μg/mL)分别使用本仪器和全自动生化仪测试。测试结果表明，本仪器测试光值再通过拟合曲线计算出的浓度数据，误差都在该测试液允许的范围内，但是总体误差比全自动生化仪大，特别是低端的 3个浓度的测试液，用本仪器无法区分。但是从医院门诊做初步判断需要快速出结果的要求角度而言，本仪器能够在10,min内给出检验结果，相比生化仪需要隔天甚至几天出结果，检验速度上明显优于生化仪。

4 结 论

设计本仪器的主要目的是为了满足快速检验的需求，在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果。本仪器主要适用于新型的使用全血进行 C反应蛋白的免疫检验要求，设计了磁力搅拌、带触摸屏的液晶屏、微型打印机等适应快速出结果的检验要求的功能模块。为了达到检验性能指标的要求，采用了与上位机PC联机进行精确的曲线拟合计算，从而达到在测量范围内 10个浓度测试液误差都在允许范围内的指标，满足了快速检验的需求。■

［1］王慧，罗炜，陈涛. 免疫透射比浊法CPR检测试剂盒的性能评价[J]. 中国热带医学，2006，6(8)：1479-1480.

［2］张弢，许培仁，雷素萍. 胶乳增强免疫比浊实验中标准曲线的模式[J]. 第四军医大学学报，2005(3)：392.

［3］周记芗. 实用回归分析方法[M]. 上海：上海科学技术出版社，1990：48-50.