RP-HPLC法测定替比夫定片的有关物质及含量

赵婧伊，左志辉

(1. 天津市新华中学 天津300204；2. 天津市药品检验研究院 天津300070)

替比夫定片用于有病毒复制证据以及有血清转氨酶持续升高或肝组织活动性病变证据的慢性乙型肝炎的治疗[1]。替比夫定片现行国家标准为 WS1-(X-077)-2010Z，在国外药典中未见收载。试验研究发现，有关物质检查供试品溶液浓度较低，为0.12,mg/mL，胸腺嘧啶峰响应很小，几乎无法检出，该方法灵敏度较低。含量测定供试品溶液配制方法不合理，使测定结果不准确，且有机溶剂使用量较大，产生较大浪费。经方法学验证，对有关物质浓度与含量测定供试液的配制方法进行了修订，并将系统适用性溶液中胸腺嘧啶与替比夫定浓度均增加5倍，修订为 0.6,μg/mL(0.1%,)和 0.6,mg/mL，提高了方法的灵敏度与准确度。本研究建立的方法将更有效控制我国替比夫定片的质量。

1 材 料

安捷伦 HP1260型高效液相色谱仪；安捷伦HP1200型高效液相色谱仪；色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ 柱(3,mm×150,mm，3,μm)、Agilent SB-Ag柱(5,mm×250,mm，5,μm)。

乙腈为色谱纯，水为去离子水。替比夫定、胸腺嘧啶对照品均由北京某制药有限公司提供(批号分别为 H2982、H3127)，纯度 100.0%,、99.8%,。替比夫定片由北京某制药有限公司生产，批号分别为 X0593、X0587、X0584。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

用亲水性十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(YMC-Pack ODS-AQ 柱，150,mm×3,mm，3,μm)；以水为流动相 A，以乙腈-水(40∶60)为流动相 B，按表 1进行梯度洗脱；柱温为 40,℃；检测波长为220,nm。称取胸腺嘧啶 6,mg，置 100,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)溶解并稀释至刻度，摇匀，量取1,mL置100,mL量瓶中，加替比夫定60,mg，加乙腈-水(5∶100)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。取 10,μL注入液相色谱仪，调节流速使替比夫定峰的保留时间约为 9,min，胸腺嘧啶峰与替比夫定峰的相对保留时间为0.7。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制备

2.2.1 含量测定供试品溶液的制备

取本品 10片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于替比夫定 120,mg)，置 100,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)适量，超声 15,min使替比夫定溶解，放冷，用乙腈-水(5∶100)稀释至刻度，摇匀，取混悬液适量，4,000,r/min离心 15,min，精密量取上清液 5,mL，置 50,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.2 含量测定对照品溶液的制备

精密称取替比夫定对照品约 30,mg，置 250,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)适量，超声使溶解，放冷，用乙腈-水(5∶100)稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.3 有关物质供试品溶液的制备

精密量取含量测定项下离心后上清液 5,mL，置10,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.4 有关物质对照品溶液的制备

精密量取含量测定项下的对照品溶液 5,mL置200,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液(0.5%,)。

2.3 线性试验

取替比夫定对照品约 30,mg，精密称定，置250,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)适量，超声使之溶解、放冷，并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。分别精密量取 0.05,mL、0.10,mL、0.25,mL、0.5,mL、2.5,mL、5,mL、10,mL 置 100,mL 量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀释至刻度，摇匀，分别精密取上述溶液与贮备液10,μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以替比夫定浓度 C对峰面积 A作标准曲线，在 0.06～241.8,μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为A＝32.592,C+4.672，r＝0.999,9(n＝7)。

取胸腺嘧啶对照品约 12,mg，精密称定，置200,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)适量，超声使溶解、放冷，稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，分别精密量取 0.5,mL、1,mL、5,mL、10,mL、20,mL，置 100,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀释至刻度，摇匀，分别精密量取上述溶液 10,μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以胸腺嘧啶浓度C(μg/mL)对峰面积A作标准曲线，在 0.29～11.63,μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为：A＝54.568,1,C+0.541,4，r＝1.000,0(n＝5)。

2.4 精密度试验

精密称取替比夫定片(批号 X0584)细粉适量(约相当于替比夫定 120,mg)，共 6份，按“2.1”项方法测定，胸腺嘧啶均未检出，其他单一最大杂质均为0.021%,，其他杂质总量均为 0.040%,。本方法的精密度较好。

2.5 重复性试验

精密量取有关物质检查项下的对照溶液(0.5%)10,μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，6针峰面积RSD为0.21%。结果表明，本方法重复性较好。

2.6 加样回收率试验

分别取替比夫定对照品 0.096,mg、0.12,mg、0.14,mg，置 100,mL量瓶中，每个浓度配制 3份，并分别加入相应量的空白辅料，加乙腈-水(5∶100)适量，超声15,min使溶解、放冷，用乙腈-水(5∶100)稀释至刻度，摇匀，取混悬液适量，4,000,r/min离心15,min，精密量取上清液 5,mL，置 50,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别相当于 80%,、100%,、120%,含量浓度的 3组各 3份。另取替比夫定对照品 30,mg，至 100,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)适量，超声使溶解，放冷，并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，按照有关物质项下色谱条件分别进样 10,μL，测定峰面积，计算平均回收率为100.0%，RSD 为0.40(n＝9)，结果见表 2。

表2 含量测定回收率结果Tab.2 Recoveries of telbivudine content determination

2.7 灵敏度测试溶液

取对照品溶液(0.5%,)稀释至替比夫定浓度约为0.18,μg/mL，按照含量测定项下色谱条件测定，替比夫定峰信噪比为 16，主峰面积可准确积分，以此作为灵敏度测试溶液(0.03%,)。

2.8 最低检出限

取对照溶液(0.5%,)逐步稀释，量取 10,μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，替比夫定与胸腺嘧啶的最小检出限均为 0.06,μg/mL(0.01%,)。

2.9 溶液稳定性

取供试品溶液(批号 X0593)，分别放置 0,h、15,h、24,h后测定，记录色谱图，胸腺嘧啶均未检出，其他单一最大杂质分别为 0.021%,、0.021%,、0.022%,；其他杂质总量分别为 0.040%,、0.037%,、0.049%。表明供试品溶液在24,h内稳定。

2.10 粗放度试验

表3 有关物质测定结果(粗放度试验)Tab.3 Test results of related substances(extensive degree test)

方法 1：Agilent1260型高效液相色谱仪；YMCPack ODS-AQ 柱(150,mm×3,mm，3,μm)；

方法 2：Agilent1200型高效液相色谱仪；Agilent SB-Ag柱(250,mm×4.6,mm，5,μm)。

使用2种不同型号的色谱柱测定有关物质，结果基本一致(见表3)。YMC-Pack ODS-AQ柱的性能略优于安捷伦色谱柱，故在拟定质量标准中予以列出。

3 样品测定与结果

3.1 含量测定结果

按“2.2.1与2.2.2”项下方法制备供试品溶液与对照品溶液；照“2.1”项下的色谱条件，精密量取供试品溶液与对照品溶液各 10,μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。3批样品含量测定结果见表 4，与原国标方法结果基本一致。含量测定典型色谱图见图1、2。

表4 样品含量测定结果(%)Tab.4 The results of content determination(%)

图1 对照品溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of reference solution

图2 供试品溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of test solution

3.2 有关物质测定结果

图3 有关物质检查-对照溶液(0.5%)色谱图Fig.3 Chromatogram of reference solution

图4 有关物质检查-供试品溶液(X0584)色谱图Fig.4 Chromatogram of test solution

图5 有关物质检查-流动相(溶剂)色谱图Fig.5 Chromatogram of mobile phase

图6 有关物质检查-空白辅料色谱图Fig.6 Chromatogram of blank solution

按“2.2.1与2.2.2”项下方法制备供试品溶液与对照品溶液，取灵敏度测试溶液10,µL注入液相色谱仪，主成分色谱峰的信噪比应不小于10。照含量测定项下的色谱条件，精密量取供试品溶液与对照溶液各10,µL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有与胸腺嘧啶相应的杂质峰，按外标法计算并乘以0.6的校正因子，不得超过替比夫定标示量的 0.2%，其他单个杂质不得超过替比夫定标示量的 0.1%，其他杂质总量不得超过替比夫定标示量的 0.3%，各杂质总量不得超过替比夫定标示量的0.5%。3批样品测定结果见表 2方法 1，典型色谱图见图 3～7。

图7 系统适用性试验Fig.7 Chromatogram of system suitability solution

4 讨 论

4.1 系统适用性试验

原国家标准有关物质检查与含量测定供试品溶液浓度一致，均为 0.12,mg/mL。按原国家标准，照含量测定项下进行系统适用性试验，采用 Agilent SBAq柱(250,mm×5,mm，5,μm)，系统适用性溶液无法检出胸腺嘧啶峰。改用 YMC-Pack ODS-AQ柱(150,mm×3,mm，3,μm)，胸腺嘧啶峰虽可检出，但响应很小，灵敏度较低。经试验，将胸腺嘧啶与替比夫定浓度均增加 5倍，修订为 0.6,μg/mL(0.1%)和0.6,mg/mL。经粗放度试验验证，不同型号的 2种色谱柱均可检出胸腺嘧啶，提高了方法的灵敏度。

4.2 有关物质供试品溶液浓度的选择

按原国家标准方法测定替比夫定片有关物质，3批样品均未检出杂质。根据系统适用性试验结果，相应地将有关物质供试品溶液浓度增加5倍，修订为0.6,mg/mL。含量测定的供试品溶液浓度仍维持原标准浓度0.12,mg/mL不变。

4.3 含量测定供试品溶液的配制

原国家标准含量测定中规定“取本品 20片，置于已定容的 1,000,mL乙腈-水(5∶100)溶液中……”。经试验，加入替比夫定片20片后，溶液体积会增加至 1,015,mL。原质量标准的供试品溶液配制方法不合理，对含量测定结果影响较大，且产生很大浪费。经试验，将供试品溶液的配制方法修订为“取本品 10片，精密称定，研细混匀，精密称取适量(约相当于替比夫定0.12,g)，置100,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)适量，超声 15,min使替比夫定溶解……”。

4.4 离心与滤膜滤过的比较

供试品溶液分别采用离心与滤膜滤过，含量测定结果一致，均为 98.6%。故维持原国家标准的方法，离心后取上清液稀释。■

［1］陈新谦. 新编药物学[M]. 14版. 北京：人民卫生出版社，1997：424.

［2］国家食品药品监督管理局标准[S]. (WS1-(X-077)-2010Z. 2010.

［3］李发美. 分析化学[M]. 5版. 北京：人民卫生出版社，2004：21.