超临界流体萃取-色谱法提纯鱼油乙酯中EPA-EE和DHA-EE

朱 靖 博， 王 鑫， 丁 燕

( 1.大连工业大学 食品学院， 辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 植物资源化学与应用研究所， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

海洋鱼油中含有丰富活性成分，其中，二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)具有舒张血管、抑制血小板凝集及预治老年痴呆等多种生理活性及保健功能[1-3]，已成为近年来保健食品和药品研发的热点。传统的EPA与 DHA分离纯化方法包括尿素包合法[4]、有机溶剂萃取法[5]等，存在溶剂消耗多、产品纯度差等问题，无法进行有效富集分离。

随着超临界技术的兴起与日渐发展，国内外对于利用超临界CO2技术提纯鱼油中EPA和DHA的研究报道已屡见不鲜，刘伟民等[6]利用连续精馏浓缩及正交试验的方法进行分离纯化，得到二者混合物质量分数为83%，回收率为84%。FIORI等[7]通过调整压力、温度等参数，进行C20和C22组分有效分离，纯度达到85%。本实验在已有研究基础上，将超临界流体萃取、精馏及色谱技术有效结合，为工业化生产提供理论依据。寻求更有效提纯EPA-EE和DHA-EE的方法，探索最优工艺。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 原料与试剂

纯度为92%的EPA和纯度为88%的DHA标准品，仁普苏州药业有限公司；纯度为18%的EPA-EE和纯度为12%的DHA-EE，山东禹王实业有限公司；CO2，大连富洋气体有限公司；氮气，大连大特气体有限公司；正己烷，色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

超临界流体萃取-色谱设备(自制)；GC7890F气相色谱仪，上海天美科学仪器有限公司；P270高压恒流泵，大连依利特分析仪器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 超临界CO2萃取条件

超临界流体萃取-色谱一体装备的原理流程图如图1所示。精馏塔高度2.8 m，内径3 mm，系统耐压30 MPa，包括七段控温塔，温度由下至上梯度升高，原料进料口包括上中下三处，CO2在塔底进入，携带样品依次进入上一级精馏塔。

设备工作时，首先设置萃取塔的温度梯度；待温度显示值稳定后打开冷井，接通CO2，体积流量可通过控制CO2泵头的转速控制；持续通入CO2控制压力；待压力稳定后，通过高压恒流泵控制进料量，注入鱼油乙酯样品；超临界CO2携带样品进入精馏塔，轻组分先从柱顶出来，通过管路，进入分离器，而重组分因为溶解度小留在塔内，待减压后得到分离器和塔底馏分；馏分中所得EPA-EE 和DHA-EE的含量用气相色谱测定。

图1 超临界流体萃取-色谱设备结构

1.2.2 超临界色谱条件

萃取罐填料为300～400目硅胶，干法上样，同时在萃取罐下方抽真空使填料装填紧密；将萃取塔底的油样泵入萃取罐底部，上样量10 mL，以超临界CO2为流动相，进一步分离提纯EPA-EE和DHA-EE。整个色谱分离过程分为两段，截取第一段用于除掉EPA-EE和DHA-EE之前的脂肪酸乙酯；截取第二段主要是实验所需的经提纯的EPA-EE和DHA-EE，用气相色谱检测。

1.2.3 气相色谱仪分析

色谱柱为SE-54毛细管柱，涂布厚度0.5 μm，内径0.32 mm，柱长30 m。操作温度：柱温230 ℃，进样口温度280 ℃，检测器(FID)温度280 ℃；升温程序：初始温度230 ℃，持续2 min，以10 ℃/min升温至250 ℃并持续10 min；气体体积流量由压力控制，载气(N2)压力0.5 MPa，燃气(H2)体积流量30 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 进样口的选择

在萃取温度梯度40～90 ℃、萃取压力14 MPa、CO2体积流量100 mL/min、样品进样速率2 mL/min、总进样量200 mL条件下，对精馏柱上、中、下3个进料端口分别进料，样品经超临界CO2萃取，EPA-EE和DHA-EE萃取产物在塔底富集。萃取过程中，轻组分随超临界CO2进入分离器，分离比率越高，EPA-EE和DHA-EE的回收率越低，控制其进入分离器的量将有效提高产物得率。结果如表1所示，通过分离器接收量、塔底接出量及产物得率结果比较确定，下端进料口为最佳进量端口。

表1 不同进料端口对鱼油提取效果的影响

2.2 温度梯度

以塔底EPA-EE和DHA-EE总质量分数为考核指标，如表2所示，随着塔顶温度的增加(即温度梯度的增大)，塔底组分总质量分数不断增加。以萃取压力14 MPa、CO2体积流量100 mL/min和样品进样速率2 mL/min为条件，经系列参数比对，确定塔顶温度为90 ℃。以EPA-EE和DHA-EE回收率为考核指标，结果如表2所示。温度梯度对产品回收率具有线性影响，随着顶端温度的升高，两者的回收率都随之升高，当温度达到80 ℃，回收率分别达到58.6%和84.9%；当温度升高到90 ℃时，回收率分别达到60%和90%，亦表明，超临界CO2的溶解性随温度的降低而增强，使得EPA-EE和DHA-EE被携带进入分离器中的可能增大。

表2 温度梯度对鱼油提取效果的影响

2.3 压 力

萃取压力高低决定了超临界CO2的密度以及样品分子间的传质效率，最终影响样品的溶解效果[8]。

压力对萃取过程的影响如表3所示，塔底EPA-EE和DHA-EE的质量分数随压力的增大而先增加后减少。产品回收率结果显示，回收率随着压力的增大逐渐降低，当压力降低到15 MPa时，回收率降低到77.0%和56.4%。此外，在温度梯度40～90 ℃、CO2体积流量100 mL/min、鱼油进样速率2 mL/min的条件下，综合考虑选择萃取最佳压力为14 MPa，此结果与Maschietti等[9]的规律相符合。

表3 压力对鱼油提取效果的影响

2.4 CO2体积流量

由表4可知，在温度梯度40～90 ℃、萃取压力14 MPa、鱼油进样速度2 mL/min的条件下，CO2体积流量在实验范围内增高，塔底EPA-EE和DHA-EE的含量也变高，所以选择CO2的最佳体积流量为100 mL/min。CO2体积流量对回收率有一定影响但并不显著，该结果与Perretti等[10]对CO2体积流量条件的考查结果相符合。

表4 CO2体积流量对鱼油提取效果的影响

2.5 色谱分离的时间分段

在超临界流体色谱分离过程中，关键步骤是对馏出物进行有效分段，使鱼油乙酯中其他脂肪酸乙酯杂质尽量在第一段馏出物中，即20 min之前接出的分离器中的馏出物没有EPA-EE和DHA-EE；在第二段(20～30 min)接出的馏出物中，只含有少量EPA-EE，不含有DHA-EE。气相色谱检测结果表明，第二段馏分中EPA-EE质量分数为47.12%，第三段馏分中DHA-EE质量分数为39.89%，总质量分数是87.01%，提纯前后气相色谱对比见图2。

(a) 提纯前

(b) 提纯后

图2 提纯前后鱼油样品的气相色谱鉴定结果

Fig.2 Gas chromatograms of the oil fish samples before and after purified

3 结 论

通过对超临界流体萃取和色谱相结合的一体化分离装备分离过程中的萃取温度梯度、萃取压力、CO2体积流量、色谱参数等条件进行单因素试验，得到鱼油中EPA和DHA的最佳分离纯化工艺：进料口为最下端，萃取压力14 MPa，萃取温度梯度40～90 ℃，鱼油进样速率2 mL/min，超临界CO2体积流量100 mL/min，色谱柱填料为300～400目硅胶，色谱分离压力14 MPa，色谱分离温度40 ℃。在此条件下，产品中EPA-EE和DHA-EE的质量分数可由原料中的30%提升到87%。

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