海参铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及活性鉴定

车 明 月， 穆 贤， 李 学 一， 张 齐， 丛 丽 娜， 牛 庆 昌， 李 成

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

自由基是机体正常代谢的产物，参与生物体的多种生化过程，如胞内信号转导、细胞生长、免疫、防御等[1-3]。过多的自由基可造成生物膜脂质过氧化损伤，DNA/RNA/氨基酸氧化交联，从而破坏其具有的结构或功能[7]。直接补充外源性抗氧化酶(SOD、CAT)能有效帮助机体清除过多的活性氧，减轻或阻止氧化损伤[8-10]。

海参能很好地抵御氧化胁迫型环境带来的氧化损伤，其超氧化物歧化酶(SOD1)是机体自身抗氧化损伤的重要组成部分[9-11]。研究海参种属SOD1具有很高的开发前景和应用价值；同时，作为辽宁省重要的海产养殖经济物种，研究开发海参SOD1，可以很好地提高其经济附加值。实验利用体外重组表达的Aj-SOD1，并检验其活性，以期为深入研究Aj-SOD1性质提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 海参来源及处理

海参采购于大连新长兴海参市场。在实验室条件下，对海参进行饥饿处理3～5 d，清空肠组织。

1.1.2 菌种与试剂

大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，本实验室保存。质粒提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司；Protein markers，大连宝生物有限公司；Ni2+-NTA 亲和层析填料，GE healthcare公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 提取海参肠组织总RNA

采用Trizol法提取海参肠组织的总RNA。1.5%的琼脂糖凝胶电泳验证RNA提取情况。

1.2.2 反转录cDNA第一链

参照反转录试剂盒使用说明，以海参肠组织总RNA为模板，反转录获得cDNA第一链。

以反转录产物为模板，采用Aj-β-actin 特异性引物：P1-AGTATTTCCTCTCTCTGGTGGAGCG和P2-TCATCACCATTGGCAACGAAAGGT扩增海参β-actin基因片段(278 bp)，琼脂糖凝胶电泳验证后，检测反转录后的结果。PCR扩增条件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s，扩增30 cycles。

1.2.3 扩增海参SOD1全长cDNA序列

以反转录获得的cDNA为模板，通过引物P3-ATGCTCTACAAGCCGTTTGCGTTT和P4-TTAGACCTGTTTGATACCAATGA，扩增海参SOD1蛋白的全长编码序列(459 bp)。PCR条件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s，扩增30 cycles。1.5%琼脂糖凝胶电泳验证结果。通过TA克隆构建克隆质粒pMD18-Aj-SOD1，测序验证。

1.2.4 构建海参SOD1重组表达载体

以pMD18-Aj-SOD1为模板，通过引物P5-CATATGATGCTCTACAAGCCGTTTGCGTTT (NdeⅠ)和P6-CTCGAGTTAGACCTGTTTGATACCAATGA (XhoⅠ)，扩增带有酶切位点的SOD1基因片段，构建克隆载体pMD18-Aj-SOD1 (XhoⅠ/NdeⅠ)。分别对其和表达载体pET30a进行双酶切，构建重组表达载体pET30a-Aj-SOD1，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。菌落PCR检测阳性转化子，并测序验证。

1.2.5 海参SOD1蛋白的诱导表达

将重组表达质粒pET30a-Aj-SOD1转化到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，37 ℃、180 r/min过夜活化。按1%的接种量放大培养。当菌液OD600在0.6～0.8，加入0.1 mmol IPTG、100 μmol/mL 的CuSO4和ZnCl2。诱导表达8 h后，SDS-PAGE电泳检测海参SOD1蛋白的表达情况。

1.2.6 邻苯三酚自氧化法检测海参SOD1活性

以BL21(DE3)/pET30a空载体为阴性对照，根据吸光度的变化，利用紫外分光光度计在320 nm 处测定SOD1活性[12]，检测条件见表1。

表1 海参SOD1活性的检测条件

2 结果与讨论

2.1 海参肠组织总RNA的提取及反转录

利用Trizol法提取海参肠组织的总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。结果表明，成功地从海参肠组织提取了总RNA，且其纯度较高，无明显降解和污染，完全符合后续实验要求。

图1 海参肠总RNA的提取

Fig.1 Extraction of total RNA from intestinal tissue ofApostichopusjaponicusdetected by agarose gel electrophoresis

以海参肌动蛋白(β-actin)为内参基因，通过引物P1/P2，检测反转录情况。结果表明，mRNA成功地反转录成cDNA。

2.2 Aj-SOD1的扩增及克隆载体的构建

按照图2中的方案，以cDNA为模板，根据Aj-SOD1上下游引物P3/P4，扩增其全长CDS编码序列。鉴定结果如图3所示，在400～500 bp有一条明亮的单一条带，为459 bp，通过TA连接构建到克隆载体pMD18-T上，并转化到大肠杆菌。挑取的阳性转化子经过测序比对与NCBI数据库上Aj-SOD1基因序列完全一致。结果表明，实验成功地获得了Aj-SOD1的全长编码基因，并构建了含有Aj-SOD1基因的克隆载体pMD18-Aj-SOD1。

图2 克隆载体pMD18-Aj-SOD1的构建

图3 凝胶电泳检测Aj-SOD1基因扩增

2.3 Aj-SOD1表达载体的构建及转化、筛选

根据方法“1.2.4”，在克隆载体pMD18-SOD1目的基因序列上下游引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，获得新的克隆载体pMD18-Aj-SOD1，方案如图4所示。分别对克隆载体pMD18-Aj-SOD1和表达载体pET-30a(+)进行双酶切，获得线性表达载体大片段和Aj-SOD1目的基因小片段，结果如图5所示。

将获得的基因片段和表达载体进行T4连接，构建重组表达载体pET30a-Aj-SOD1。对阳性转化子进行菌落PCR检测，结果如图6所示，在分子质量约400～500 bp处出现明显条带。测序结果表明，实验成功构建海参超氧化物歧化酶重组表达质粒pET30a-Aj-SOD1。

图4 表达载体pET30a-Aj-SOD1构建方案

M1，100 bp DNA marker；M2，1 kb DNA marker；1，pMD18-Aj-SOD1酶切前；2，pMD18-Aj-SOD1酶切后；3，pET30a(+)酶切前；4，pET30a(+)酶切后

图5 pMD18-Aj-SOD1和pET30a(+)双酶切结果

Fig.5 Double enzyme digestion of pMD18-Aj-SOD1 and pET30a(+) detected by gel electrophoresis

2.4 Aj-SOD1蛋白表达及诱导条件

构建海参超氧化物歧化酶的原核表达系统BL21(DE3)/pET30a-Aj-SOD1。对其进行IPTG诱导，表达海参超氧化物歧化酶目的蛋白。检测结果如图7所示，空载体无论是上清还是沉淀几乎没有Aj-SOD1蛋白表达，而基因工程菌BL21(DE3)/pET30a-Aj-SOD1上清与沉淀相比明显在上清中的表达量更高，杂带较少。与阴性对照菌株比较，经IPTG诱导后，在15 ku附近出现一条明显的蛋白条带，与预测的Aj-SOD1的分子质量为14.956 ku基本相符。

图6 Aj-SOD1基因扩增的结果检测

M，标准蛋白marker；1，空载BL21(DE3)/pET30a诱导8 h 后的破菌沉淀；2，空载BL21(DE3)/pET30a诱导8 h后的破菌上清；3，BL21(DE3)/pET30a-Aj-SOD1诱导8 h后的破菌沉淀；4，BL21(DE3)/pET30a-Aj-SOD1诱导8 h后的破菌上清

图7 SDS-PAGE凝胶电泳检测Aj-SOD1蛋白的表达

Fig.7 Aj-SOD1 expression result detected by SDS-PAGE

实验结果表明，基因工程菌成功表达了可溶的仿刺参超氧化物歧化酶蛋白。蛋白表达条件为0.1 mmol/L IPTG、37 ℃、180 r/min条件下诱导8 h，体外成功获得高表达、可溶性的海参蛋白SOD1。

2.5 海参SOD1抗氧化活性

图8 邻苯三酚法检测海参SOD1蛋白的抗氧化性

Fig.8 Antioxidant activity of Aj-SOD1 protein determined by pyrogallol oxidation method

3 结 论

通过反转录体外获得海参SOD1蛋白的基因编码序列，经酶切、连接成功构建目的基因表达载体pET30a-Aj-SOD1。借助原核表达宿主BL21(DE3)，体外成功诱导表达了具有抗氧化活性的海参超氧化物歧化酶蛋白。

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