云南苦荞茶传统与微波冲泡工艺的 响应面优化及比较

李会端,余建中,杨光兴,广国安

(楚雄师范学院化学与生命科学学院,云南楚雄 675000)

我国苦荞资源丰富,主产地分布于四川、云南、贵州和陕西等高寒山区。苦荞具有较高的食用和药用营养价值。苦荞茶是将苦荞麦、苦荞植株全株或不同部分经由筛选、烘焙等工序加工而成的苦荞次级冲饮品[1]。苦荞茶中富含芦丁等黄酮类化合物,具有软化血管、降血压,调节内分泌,预防心脏病和提高肌体免疫力等功效[2-3],苦荞茶作为一类纯天然的绿色保健饮品受到了广泛的关注和推崇。

文献中报道的黄酮类化合物提取方法有浸提法(回流法)、酶解法、微波提取、超声提取、超临界流体萃取法等[4-6,10]。浸提法(回流法)是黄酮化合物传统提取技术的代表；肖诗明[7]和郭刚军[8]分别报道了水提和有机溶剂乙醇浸提苦荞茶中总黄酮；王斯慧等[9]报道了苦荞麸皮中总黄酮的超声提取工艺优化过程,并采用了多次提取方法；王敏等[10]报道了纤维素酶辅助乙醇浸提苦荞中的总黄酮的过程及优化。奕梅等[11]实现了CO2超临界流体对苦荞总黄酮的萃取过程,该工艺具有绿色、高效等特点。高频微波辐射有助于促进苦荞黄酮类化合物的溶出,田世龙[12]报道了微波辅助乙醇浸提苦荞总黄酮的工艺。

国内外关于茶品冲泡工艺的研究报道日渐增多,传统方法一般使用80 ℃左右的热水甚至沸水冲泡,控制较高的冲泡温度可以增加黄酮类化合物等有效成分的溶出;通过延长冲泡时间使得有效成分的溶出过程达到平衡;又可采取多次冲泡的方式最大程度的提高有效成分的溶出率[13-17]。然而传统的冲泡工艺,过高的冲泡温度降低了茶品的清香和口感,一味的延长冲泡时间又缺乏操作可行性。本文首次提出苦荞茶微波冲泡工艺与传统冲泡工艺对比,通过研究以冲泡液中总黄酮得率为响应值的两种苦荞茶冲泡工艺的响应面优化过程,对比不同冲泡工艺对冲泡液中总黄酮得率的影响,以期为苦荞茶饮用和营养价值的开发和利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

谷冠牌苦荞茶 产自云南乌蒙山-东川红土地苦荞种植基地,昆明五谷王食品有限公司;芦丁 优级纯,日本和光纯药工业株式会社;无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、浓氨水等其他试剂 分析纯,天津市化学试剂厂。

Alpha-1502分光光度计 上海谱元仪器有限公司;CP224C电子天平 奥豪斯仪器上海有限公司;HH-S2型电热恒温水浴锅 金坛市大地自动化仪器厂;SHZ-ⅢA循环水式多用真空泵 河南省豫华仪器有限公司;102型电热鼓风干燥箱 威瑞科教仪器有限公司;G80F23CN3P-Q5(QO)型微波炉 广东格兰仕微波炉电器制造有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 苦荞茶粉末的制备 苦荞茶→60 ℃恒温干燥箱干燥处理12 h→粉碎后过40目筛→干粉备用。

1.2.2 苦荞茶传统冲泡工艺

1.2.2.1 传统冲泡流程 准确称取5.0000 g苦荞茶粉末,用滤纸包裹后,置于250 mL容量瓶中,取250 mL蒸馏水在光波炉上烧至80 ℃,迅速转移到锥形瓶中,用保鲜膜封口,置于80 ℃恒温水浴锅中浸泡15 min。将滤纸包取出,精确量取并记录冲泡液体积,得苦荞茶传统冲泡液。

1.2.2.2 单因素实验设计 考察各单因素水平对苦荞茶传统冲泡液中总黄酮得率的影响。固定单次冲泡,冲泡温度80 ℃和冲泡时间15 min,考察1∶100、1.5∶100、2∶100、3∶100、4∶100、8∶100 (g∶mL)茶水比的影响。固定较佳茶水比2∶100 (g∶mL),冲泡温度80 ℃和冲泡时间15 min,考察1、2、3、4、5、6冲泡次数的影响。固定单次冲泡,茶水比2∶100 (g∶mL)和冲泡时间15 min,考察50、60、70、80、90、100 ℃冲泡温度的影响。固定单次冲泡,茶水比2∶100 (g∶mL)和冲泡温度 90 ℃,考察7.5、15.0、22.5、30.0、37.5、45.0 min冲泡时间的影响。

1.2.2.3 响应面实验设计 结合单因素实验结果,固定单次冲泡,选取茶水比、冲泡温度和冲泡时间三因素,每个因素设计三个水平,采用-1,0,+1编码,以冲泡液中总黄酮得率(Y)为响应值,建立Box-Benhnken 响应面分析模型,如表1所示。

表1 响应面分析的因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.3 苦荞茶微波冲泡工艺

1.2.3.1 微波冲泡流程 准确称取4.0000 g的苦荞茶粉末于250 mL锥形瓶中,加入200 mL蒸馏水,保鲜膜封口,调节微波炉功率300 W,微波90 s。取出冷却至室温,抽滤,准确量取并记录冲泡液体积,得苦荞茶微波冲泡液。

1.2.3.2 单因素实验设计 考察各单因素水平对苦荞茶微波冲泡液中总黄酮得率的影响。固定微波功率300 W和微波时间90 s,考察1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、6∶100、8∶100 (g∶mL)茶水比的影响。按照上述最佳茶水比,固定微波功率300 W,考察80、100、120、140、160、180 s微波时间的影响。按照上述最佳茶水比和微波时间,考察100、200、300、400、500 W微波功率影响。

1.2.3.3 响应面实验设计 根据单因素实验结果,固定单次冲泡,选取茶水比、微波时间和微波功率三个因子的水平并以-1,0,1编码,以微波冲泡液中总黄酮得率(Y)，使用Design-Expert 8.06软件，进行Box-Benhnken实验设计，实验设计各因子编码水平如表2所示。

表2 响应面分析的因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 冲泡液总黄酮得率的计算

1.2.4.1 标准曲线的制作 精确称取芦丁标准品0.0250 g,加入70%乙醇定容到100.00 mL,得0.25 mg·mL-1的芦丁标准溶液,摇匀备用。采用分光光度法制作标准曲线,吸量管精确吸取芦丁标准溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00 mL于25 mL的比色管中,依次加入NaNO2-AI(NO3)3-NaOH显色,用70%乙醇定容,静置15 min后,使用最大吸收波长495 nm扫描吸光度。以吸光度为纵坐标,芦丁标准液浓度为横坐标,绘制标准曲线。

1.2.4.2 总黄酮得率的计算 准确移取19.00 mL苦荞茶冲泡液于25 mL比色管中,依次加入NaNO2-AI(NO3)3-NaOH溶液共6 mL,摇匀、静置15 min。使用最大吸收波长495 nm测试吸光度。代入回归方程,按照下面公式计算冲泡液中总黄酮得率。

式中，X:测试液黄酮浓度(mg·mL-1);V:苦荞茶冲泡液的定容体积(mL);M:称取苦荞茶质量(g)。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

芦丁标准曲线见图1,拟合线性方程Y=10.586X-0.0018,线性相关系数为R2=0.9993。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin solution

2.2 苦荞茶传统冲泡工艺研究

2.2.1 单因素实验结果

2.2.1.1 茶水比对总黄酮得率的影响 如图2所示,随着茶水比的增加,苦荞茶冲泡液中总黄酮得率先升高后降低,当茶水比为2.00∶100 (g∶mL)时,冲泡液中总黄酮得率达到最高值0.026%。继续增加茶水比,总黄酮的得率开始降低,且茶水过浓还会导致茶水苦味增加口感变差。

图2 茶水比对冲泡液中总黄酮得率的影响Fig.2 Result of tea weater ratio on the extraction ratio of total flavonoids

2.2.1.2 冲泡次数对总黄酮得率的影响 如图3所示,随着冲泡次数增加,冲泡液中总黄酮得率虽然呈现降低趋势,但第六次冲泡液中总黄酮的得率仍相当于第一次冲泡液中总黄酮得率的55%,且多次冲泡后苦荞茶冲泡液的色态和口感良好,上述结果表明,苦荞茶饮品可进行多次冲泡。

图3 冲泡次数对冲泡液中总黄酮得率的影响Fig.3 Result of brewing frequency on the extraction ratio of total flavonoids

2.2.1.3 冲泡温度对总黄酮得率的影响 如图4所示,随着冲泡温度增加,黄酮类化合物的溶出速率增大,冲泡液中总黄酮得率呈上升趋势,冲泡温度在90 ℃以上时,冲泡液中黄酮得率略有降低。最佳冲泡温度为90 ℃,此时冲泡液中总黄酮得率为0.025%。

图4 冲泡温度对冲泡液中总黄酮得率的影响Fig.4 Result of brewing temperature on the extraction ratio of total flavonoids

2.2.1.4 冲泡时间对总黄酮得率的影响 如图5所示,冲泡液中总黄酮得率随冲泡时间延长而增大,冲泡时间30 min后总黄酮得率趋于恒定。且随着冲泡时间的延长,苦荞茶冲泡液出现少量沉淀物且口感苦味增加,因此固定最佳冲泡时间30 min,此时冲泡液中总黄酮得率为0.0353%。

图5 冲泡时间对冲泡液中总黄酮得率的影响Fig.5 Result of brewing time on the extraction ratio of total flavonoids

2.2.2 响应面优化苦荞茶传统冲泡工艺

2.2.2.1 多元响应模型的建立 云南苦荞茶传统冲泡工艺的响应面分析实验方案如表3所示,结果显示,冲泡液中总黄酮得率介于0.019%～0.036%之间。当冲泡茶水比2.00∶100 g·mL-1,冲泡温度和时间分别为100 ℃和45 min时,苦荞茶冲泡液中总黄酮得率对应最大值0.036%。拟合实验数据,获得以冲泡液中总黄酮得率为响应值的多元回归模型为:

Y1(%)=+0.034+1.737E-004A+1.077E-003B+5.596E-003C+9.500E-004AB+5.225E-004AC-2.400E-004BC-7.535E-003A2-4.558E-003B2-1.530E-003C2

表4 响应面分析多元回归模型的ANOVA分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)for response surface quadratic model

注:***p<0.001极其显著;**p<0.01非常显著;*p<0.05显著。

表3 响应面分析方案及结果Table 3 RSM design and experimental results of total flavonoid yield

2.2.2.2 多元响应模型的方差(ANOVA)分析 上述多元Quadratic响应模型的方差分析结果如表4所示。p值大小反映多元模型及各响应因子对响应值的显著性水平。模型的p值0.0112,模型失拟项2.955E-05极低,预示模型及各响应因子的显著性影响。相关系数(0.9457)表明94.57%的实验数据可用该数学模型解释,实验误差较小;变异系数(9.159%)说明多元模型有一定的重现性,信噪比为7.5863,远远高于4.000;相关系数和调整系数较为接近,预示着该多元二次回归模型在一定程度上可以预测最佳工艺条件,拟合响应值的理论最大值。多元模型各项的显著性水平差异分析结果显示,B2对响应值影响显著,C和A2对响应值影响非常显著。

图6的3D响应面图和等高线图可形象描述各响应因子的交互影响,进一步佐证三个交互项对响应值影响并不显著。F值预示各响应因子对苦荞茶冲泡液中总黄酮得率的影响次序为C>B>A。

图6 各响应因子对响应值的交互作用Fig.6 The interactive effects of each independent variables注:a：茶水比和冲泡温度；b：茶水比 和冲泡时间；c：冲泡温度和时间。

2.2.3 验证实验 求解多元回归方程,苦荞茶冲泡条件为茶水比2.10∶100 (g∶mL)、冲泡温度98.44 ℃、冲泡时间44.00 min时,理论拟合冲泡液黄酮得率最大为0.0357%。为方便实际操作验证实验条件修正为茶水比2.00∶100 (g∶mL)、冲泡温度100 ℃、冲泡时间45 min,重复冲泡三次,验证实验所得苦荞茶冲泡液黄酮得率为0.0350%±0.003%,与多元响应模型预测值0.0357%的绝对误差为-0.0007%,吻合的较好,佐证了该多元响应模型可有效地优化苦荞茶总黄酮的传统冲泡工艺。

2.3 苦荞茶微波冲泡工艺研究

2.3.1 单因素实验及结果

2.3.1.1 茶水比对总黄酮得率的影响 如图7所示,随着茶水比增加冲泡液中总黄酮得率先增大后减小,反应底物浓度增加促进黄酮类化合物的溶出,当冲泡茶水比为2.00∶100 (g∶mL),冲泡液中总黄酮得率达到最大值0.241%。进一步增加茶水比不仅降低了口感,底物团聚反而阻碍了黄酮类化合物的溶出。

图7 茶水比对冲泡液中总黄酮得率的影响Fig.7 Result of tea weater ratio on the extraction ratio of total flavonoids

2.3.1.2 微波时间对总黄酮得率的影响 如图8所示,随着微波时间的延长,冲泡液总黄酮浓度呈上升趋势,当微波时间为160 s,冲泡液中总黄酮得率达到最大值0.415%;再次延长微波时间,总黄酮得率开始缓慢降低,可能原是长时间微波作用导致黄酮分解,还会使冲泡液温度骤升甚至发生喷溅。

图8 微波时间对冲泡液中总黄酮得率的影响Fig.8 Result of microwave time on the extraction ratio of total flavonoids

2.3.1.3 微波功率对总黄酮得率的影响 如图9所示,随着微波功率增加,作用在底物上的微波强度增大且冲泡液温度升高,都将导致冲泡液中总黄酮得率增加;然而微波功率太大,将制约微波时间,否则冲泡液将爆沸,且微波功率太大还会导致黄酮变性分解。实验中控制最佳微波功率400 W,冲泡液中总黄酮得率0.437%。

图9 微波功率对冲泡液中总黄酮得率的影响Fig.9 Result of microwave power on the extraction ratio of total flavonoids

2.3.2 苦荞茶微波冲泡工艺的响应面优化

2.3.2.1 多元响应模型的建立 云南苦荞茶微波冲泡工艺的响应面分析方案如表5所示,响应面分析结果显示,微波冲泡液中总黄酮得率介于0.220%～0.391%之间。当冲泡茶水比2.00∶100 (g∶mL)、微波时间180 s、微波功率500 W时,实验测得微波冲泡液中总黄酮得率达到最大值0.391%。拟合实验数据,获得以微波冲泡液中总黄酮得率为响应值的多元响应模型为:

Y2(%)=+0.39-0.049A+6.750E-003B+0.014C-2.250E-003AB+2.250E-003AC-7.500E-004BC-0.092A2-9.625E-003B2-5.625E-003C2

表5 响应面分析方案及结果Table 5 RSM design and experimental results of total flavonoid yield

2.3.2.2 多元响应模型的方差(ANOVA)分析 苦荞茶微波泡液总黄酮得率与冲泡茶水比、微波时间和微波功率三个响应因子之间符合Quadratic多元响应模型,模型的p值<0.0001,失拟项1.000E-04极低,预示着该模型及各项的显著性。较小的变异系数(1.36)预示着响应模型重现性较好,置信度越高。0.9981的相关系数,说明该数学模型可用于解释几乎全部的实验数据,相关系数和调整系数小数点后第3位上的差别,较高的信噪比45.598,说明该模型对响应值一定程度上具有精确的预测作用。

表6 响应面分析多元回归模型的ANOVA分析Table 6 Analysis of variance(ANOVA)table for response surface quadratic model

图10 各响应因子对响应值的交互作用,Fig.10 The interactive effects of each independent variable注:a：茶水比和微波时间;b：茶水比 和微波功率;c：微波时间和功率。

注:***p<0.001极其显著;**p<0.01 非常显著;*p<0.05 显著。 显著性水平差异分析结果显示,B和B2对响应值影响非常显著;A、C和A2对响应值影响极其显著。三个交互项对响应值的影响可通过图10的3D响应面图和等高线图形象描述,佐证三个响应因子对响应值的交互作用并不显著。F值预示各响应因子对苦荞茶冲泡液中总黄酮得率的影响次序为A>C>B。

2.3.3 验证实验 求解多元回归方程,苦荞茶微波冲泡的最佳条件为茶水比2.00∶100 (g∶mL)、微波时间170.42 s、微波功率402.55 W,此条件下,理论拟合微波冲泡液黄酮得率最大值为0.393%。为便于操作验证实验微波冲泡条件修正为茶水比2.00∶100 (g∶mL)、微波时间170 s、微波功率400 W,在此条件下重复冲泡三次,微波冲泡液黄酮得率的实验值为0.387%±0.003%,和多元模型理论拟合值0.393%的绝对误差为-0.006%,吻合的非常好,佐证了多元模型可优化苦荞微波冲泡工艺。

3 结论

本论文在单因素实验基础上,研究了传统和微波两种苦荞茶冲泡工艺的响应面优化过程,建立了多元响应数学模型,分析模型确定最佳冲泡工艺,拟合方程获得冲泡液中总黄酮得率最大理论值。验证实验结果显示,传统冲泡最佳条件为茶水比2.00∶100 (g∶mL)、冲泡温度100 ℃、冲泡时间45 min,实验测得冲泡液总黄酮得率平均值为0.0350%±0.003%;与理论预测值0.0357%有-0.0007%的误差。微波冲泡最佳条件为茶水比2.00∶100 (g∶mL)、微波时间170 s、微波功率400 W,实验测得冲泡液总黄酮得率平均值为0.387%±0.003%;与响应模型预测值0.393%有-0.006%的误差。

传统和微波两种苦荞茶冲泡工艺中,冲泡液中总黄酮得率的实验测定值和理论拟合值吻合良好,进一步佐证多元响应模型的显著性和对响应值的精准预测作用。对比传统和微波两种冲泡工艺的实验结果:微波冲泡液中总黄酮得率相对于前者提高了将近十倍,微波冲泡极大的缩短了冲泡时间,提高了冲泡效率。

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