结直肠癌腹腔脱落癌细胞免疫细胞学检测的研究

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率随着年龄的增加而升高，其死亡率也较高，严重地威胁着人类的健康[1]。手术治疗是其主要治疗手段之一，但术后局部复发、腹腔种植转移仍是困扰胃肠外科医师的一大难题。Bruch HP等报道[2]，结直肠癌患者术中腹腔和肠腔脱落癌细胞是术后复发的一大主要原因。腹腔脱落癌细胞的检测对预测肿瘤术后复发及指导辅助治疗有重要意义，而常规的腹腔冲洗液细胞病理学（cytopathology，CP）检查敏感性低，有时难以明确诊断，进而影响了术后的辅助治疗。本研究对结直肠癌患者腹腔冲洗液进行免疫细胞化学（immuncytochemistry，ICC）检测，拟探究一种更加敏感的检测方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取大连大学附属新华医院2011年3月—2012年12月需行开腹结直肠癌手术患者50例作为研究对象。其中，男27例、女23例，年龄45～79岁，平均年龄（54.5±6.5）岁。肿瘤部位：升结肠癌8例，横结肠癌5例，降结肠癌7例，乙状结肠癌12例，直肠癌18例，其中直肠癌肿瘤位于腹膜反折下9例。手术方式：右半结肠切除术11例，横结肠切除术3例，左半结肠切除术6例，乙状结肠切除术11例，直肠Dixon手术10例，直肠Miles手术6例，直肠Hartmann手术3例。肿瘤大体形态：溃疡型19例，浸润型18例，隆起型5例，混合型8例。肿瘤的组织学分类以腺癌为主，其中低分化15例，中分化24例，高分化11例。TNM分期[3]：Ⅰ期15例、Ⅱ期21例、Ⅲ期11例，Ⅳ期3例。

1.2 方法

1.2.1 腹腔冲洗液采集 分别于开腹后和手术结束关腹前，留取腹腔冲洗液送检。手术进入腹腔后，找到肿瘤部位，用200 ml生理盐水冲洗肿瘤所在的局部腹腔，然后吸取腹腔冲洗液100 ml，注入干净容器内，迅速送检。在手术切除病变、彻底止血、关腹腔前，再用生理盐水200 ml冲洗术区，同样取腹腔冲洗液100 ml送检。

1.2.2 腹腔脱落细胞检测 将留取的腹腔冲洗液采用2 000 r/min离心5～10 min，沉淀层再度离心，取最终沉淀置于载玻片上，用吸管轻轻涂抹，厚薄均匀，制成涂片8张；稍干后，固定于95%乙醇乙醚液中15 min。2张作巴氏染色、2张作苏木精-伊红染色，采用光学显微镜寻找脱落肿瘤细胞，发现具有癌细胞特征的细胞即为阳性；另4张作免疫细胞化学染色，分别以CKLMW和CEA作为腺癌细胞标记物，以MC和Vim作为间皮细胞标记物（所用试剂为正反互补单克隆抗体，由美国Masin公司生产，购于福州迈新公司）。结果判定：CKLMW和CEA及Vim染色细胞浆呈清晰棕色为阳性，MC染色细胞膜呈清晰棕色为阳性，无色或染色浅与背景几乎一致为阴性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示；计数资料以（n，%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ICC法检测结果和CP法检测结果对比

其中，CP法检测诊断阳性的患者术前、术后ICC法检测诊断均为阳性，而ICC法术前术后检出率均高于CP法，差异具有统计学意义（P＜0.05），详见表1；说明ICC法检测的诊断敏感性优于CP法检测。

表1 50例标本ICC和CP检测结果对比 [n（%）]

2.2 ICC法检测阳性的CKLMW、CEA表达结果

有1例患者在开腹后和关腹前均为CKLMW-/CEA+，占阳性诊断的6.06%。单克隆抗体CKLMW检测的敏感度为93.94%，CEA敏感度为72.73%，两者对比，差异具有统计学意义（P＜0.05），详见表2。说明CKLMW的敏感度比CEA高。对于1例CKLMW表达阴性，而其CEA表达为阳性，说明CKLMW、CEA联合应用可以起到互补结果，进而提高了腹腔脱落癌细胞阳性检出率。

表2 ICC检测阳性的CKLMW、CEA表达结果（n）

3 讨论

结直肠癌患者腹腔内种植转移和腹膜微转移是患者术后出现复发或转移的重要原因，也是影响其行根治术后预后不良和死亡的常见原因之一。而结直肠癌患者腹腔内脱落游离癌细胞是导致腹腔内种植转移的主要根源。因此，通过腹腔冲洗液检测脱落癌细胞对于指导结直肠癌术后化疗和预后评估具有非常重要的临床意义[4]。

常规的腹腔冲洗液细胞病理学（CP）检测结直肠癌腹腔脱落癌细胞具有一定的诊断价值，但仅靠细胞形态学诊断尚存在较多假阴性，敏感性较低。尤其当癌细胞弥漫性分布于间皮细胞之间时显得更为突出，常误将反应性间皮细胞与腺癌细胞混淆。因而在保证可靠的特异性前提下，提高敏感性的关键是正确鉴别腺癌细胞与反应性间皮细胞。有国外学者报道间皮细胞MC和波形蛋白Vim对腺瘤细胞和间皮细胞的鉴别具有重要价值。CEA是分子质量为180 KD的糖蛋白，最初发现于胚胎性结肠和结肠癌中，其中胃肠道腺癌高表达，在间皮瘤和增生性间皮细胞中不表达。CKLMW是低分子量细胞角蛋白，具有严格的上皮分布特性，其主要局限于胃肠道腺癌、膀胧移行上皮细胞癌等上皮来源性肿瘤，而不与腹腔间皮细胞反应[5-6]。

本研究结果显示， 50例结直肠癌患者腹腔冲洗液中，常规CP法阳性检测率开腹前为18.0%，关腹后为26.0%；ICC法阳性检测率开腹前28.0%，关腹后为38.0%。其中手术前后CP法诊断阳性患者，采用ICC标记也均为阳性，而ICC组术前术后检出率均高于CP组，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明免疫细胞化学检测敏感性优于常规细胞病理学检测。在全部ICC检测阳性表达结果中，CKLMW的敏感度为93.94%，CEA敏感度为72.73%，两者对比，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明CKLMW作为腹腔脱落癌细胞检测免疫细胞学指标的敏感度比CEA高。其中，1例CKLMW表达阴性，但其CEA表达为阳性，说明CKLMW与CEA抗体联合应用可以起到互补作用。另外，两种检测结果均显示为关腹前的阳性率比开腹后阳性率略高，说明尽管严格执行无瘤操作的原则，外科手术仍是造成肿瘤细胞的播散种植的因素之一[7-8]。

综上所述，CKLMW联合CEA单抗的免疫化学法检测可以提高对结直肠癌腹腔脱落细胞诊断的敏感性和特异性，对于指导结直肠癌患者术后的辅助治疗，提高其生存率、减少腹腔复发转移具有重要意义。

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