红花籽粕氨基酸态氮酶法水解工艺优化

魏娜，吕凯波（武汉工商学院实验教学中心，湖北武汉430065）

红花籽，是红花（Carthamus tinctorius L.）的种子，又被称作“白平子”[1]。红花籽粕（safflower meal）是指从红花籽中提取红花籽油后得到的副产品[2]。红花作为一种新型的油料作物，目前广泛分布在世界20多个国家，其中在印度、加拿大等国产量最多[3-5]。红花籽粕本身含有较高的粗蛋白和多种氨基酸，但是目前大多数只作为廉价的肥料和饲料，使蛋白质等资源无法得到有效利用[6-7]。

氨基酸态氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量。该含量越高，说明产品中蛋白质水解率越高，氨基酸含量越高，营养越好[8-10]。随着食品科学的发展和营养知识的普及，食物蛋白质中氨基酸含量的高低越来越得到人们的重视，为拓宽红花籽粕综合利用前景，本试验对酶法辅助红花籽粕的水解工艺进行优化，从而提高红花籽粕中氨基酸态氮的含量，为日后红花籽粕综合利用及开发功能性食品提供科学数据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

1.1.1 材料

红花籽粕，产地中国。

1.1.2 仪器与试剂

电子天平：日本岛津；HS-4（B）型恒温浴槽：广东佛山；722可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；水浴恒温振荡器、79-2磁力加热搅拌器：常州国华电器有限公司；5810R离心机：德国艾本德（Eppendorf）股份公司；PB-21 pH计：德国Sartorius赛多利斯。

商业酶：胰蛋白酶（parenzyme，2 500 U/mg）、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（bacillus subtilis neutral protease，150 U/mg）、木瓜蛋白酶（papain，2 400 U/mg）购自诺维信公司；所用试剂甲醛、邻苯二甲酸氢钾、无水硫酸钾、NaOH、酚酞指示剂、盐酸、中性红指示剂等均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 测定指标及方法

1.2.1.1 标准氢氧化钠溶液的标定[11]

用酸性的邻苯二甲酸氢钾（KHC8H4O4，相对分子质量204.22）作为基准物质，可先准确称量分析纯的邻苯二甲酸氢钾3份，每份0.42 g，分别置于150 mL三角瓶，各加入20 mL无离子水，使全部溶解，加酚酞指示剂3~4滴，用待测的NaOH溶液滴定至淡红色为止，记录用去的NaOH的体积，求平均值，按下式计算得NaOH的标准浓度：

式中：m 为 KHC8H4O4的质量，g；Mr为 KHC8H4O4的相对分子质量；V为NaOH的滴定体积，mL。

1.2.1.2 甲醛滴定法[12-13]

移取2 mL抽滤的样品溶液2份，分别置于250 mL的锥形瓶中，加水25 mL；其中一份加3滴中性红指示剂，用上述标定的NaOH滴定至琥珀色为终点。另一份加入中性甲醛10 mL及3滴百里酚酞指示剂，摇匀，静置1 min，（此时蓝色消失）。再用上述标定过的NaOH溶液滴定至淡蓝色。记录两次滴定所消耗的NaOH的毫升数，用下述公式计算。

式中：N为NaOH标准溶液当量浓度，g/mL；V1为测定样品消耗NaOH标准溶液的体积，mL；V2为测定空白消耗NaOH标准溶液的体积，mL；W为样品溶液相当样品的质量，g。

1.2.2 酶解反应[14-18]

对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢杆菌中性蛋白酶分别进行水解试验，并对以下几个因素进行考察。

1.2.2.1 料液比

在酶解温度为45℃，酶用量为1%，作用时间为3 h时，每组均取5.00 g红花籽粕，料液比分别为1∶3、1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9、1 ∶11（g/mL），抽滤，用甲醛滴定法滴定，并记录消耗的NaOH体积。

1.2.2.2 酶用量

在酶解温度为45℃，作用时间为3 h时，料液比为1∶3（g/mL），每组均取5.00 g红花籽粕，酶用量分别为1%、2%、3%、4%、5%，抽滤，用甲醛滴定法滴定，并记录消耗的NaOH体积。

1.2.2.3 酶解温度

酶用量为1%，作用时间为3 h，料液比为1∶3（g/mL），每组均取5.00 g红花籽粕，选取酶解温度为30、35、40、45、50 ℃，抽滤，用甲醛滴定法滴定，并记录消耗的NaOH体积。

1.2.2.4 作用时间

在酶解温度为45℃，酶用量为1%，料液比为1∶3（g/mL），每组均取5.00 g红花籽粕，作用时间分别为 1、2、3、4、5 h 抽滤，用甲醛滴定法滴定，并记录消耗的NaOH体积。

1.2.3 数据分析

采用Origin 8.0软件和Design Expert 8.5数据分析系统进行数据分析[19]。

2 结果与分析

2.1 胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌中性蛋白酶水解红花籽粕中氨基酸态氮的影响

对3种不同酶分别水解红花籽粕工艺条件的主要因素进行单因素试验，结果见图1。

从图1可以看出，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢杆菌中性蛋白酶分别水解红花籽粕中氨基酸态氮含量最高时料液比分别为 1 ∶3、1 ∶3、1 ∶3（g/mL）；酶用量分别为2%、2%、4%；酶解温度分别为55、55、45℃；作用时间分别为 4、3、3 h。

2.2 最佳工艺条件的确定

2.2.1 胰蛋白酶水解红花籽粕的正交试验结果

图1 不同因素对3种酶分别水解红花籽粕中氨基酸态氮含量的影响Fig.1 Effect of the single-factor experiments on the amino acid nitrogen of safflower meal

根据单因素结果，以 A（料液比）、B（酶用量）、C（酶解温度）、D（酶作用时间）进行正交试验，以氨基酸态氮含量为指标的正交试验结果如表1所示。

表1 胰蛋白酶水解红花籽粕正交试验结果Table 1 Orthogonal results of safflower meal hydrolyzed by parenzyme

根据极差R大小，得出各因素影响蛋白质提取效果的主次顺序为：A（料液比）＞B（酶用量）＞D（酶作用时间）＞C（酶解温度），结果表明：胰蛋白酶水解红花籽粕的最佳工艺参数为A1B2C2D2，即料液比1∶3（g/mL）、酶用量为2%、酶解温度为45℃、酶作用时间3.0 h，在此最佳工艺进行验证试验，所得到的氨基酸态氮含量最高，达到7.7%。

2.2.2 木瓜蛋白酶水解红花籽粕的正交试验结果

根据单因素结果，以A（料液比）、B（酶用量）、C（酶解温度）、D（酶作用时间）进行正交试验，以氨基酸态氮含量为指标的正交试验结果如表2所示。

表2 木瓜蛋白酶水解红花籽粕正交试验结果Table 2 Orthogonal results of safflower meal hydrolyzed by papain

续表2 木瓜蛋白酶水解红花籽粕正交试验结果Continue table 2 Orthogonal results of safflower meal hydrolyzed by papain

根据极差R大小，得出各因素影响蛋白质提取效果的主次顺序为：A（料液比）＞D（酶作用时间）＞B（酶用量）＞C（酶解温度），结果表明：木瓜蛋白酶水解红花籽粕的最佳工艺参数为 A1B2C2D3，即料液比 1∶3（g/mL）、酶用量为2.0%、酶解温度为55℃、酶作用时间4.0 h，在此最佳工艺进行验证试验，所得到的氨基酸态氮含量最高，达到8.2%。

2.2.3 枯草芽孢杆菌中性蛋白酶水解红花籽粕的正交试验结果

根据单因素结果，以 A（料液比）、B（酶用量）、C（酶解温度）、D（酶作用时间）进行正交试验，以氨基酸态氮含量为指标的正交试验结果如表3所示。

表3 枯草芽孢杆菌中性蛋白酶水解红花籽粕正交试验结果Table 3 Orthogonal results of safflower meal hydrolyzed by bacillus subtilis neutral protease

根据极差R大小，得出各因素影响蛋白质提取效果的主次顺序为：C（酶解温度）＞B（酶用量）＞D（酶作用时间）＞A（料液比），结果表明：枯草芽孢杆菌中性蛋白酶水解红花籽粕的最佳工艺参数为A1B2C1D3，即料液比 1∶3（g/mL）、酶用量为 2.0%、酶解温度为 40℃、酶作用时间4.0 h，在此最佳工艺进行验证试验，所得到的氨基酸态氮含量最高，达到4.27%。

3 结论

1）选用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶3种商业酶分别水解红花籽粕，胰蛋白酶水解红花籽粕得到的氨基酸态氮含量为7.7%，木瓜蛋白酶水解红花籽粕得到的氨基酸态氮含量为8.2%，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶水解红花籽粕得到的氨基酸态氮含量为4.27%，可知木瓜蛋白酶水解能力较强。

2）酶法水解最佳工艺条件分别为：①胰蛋白酶：料液比 1∶3（g/mL）、酶用量为 2%、酶解温度为 45℃、酶作用时间3.0 h，氨基酸态氮含量7.7%；②木瓜蛋白酶：料液比 1∶3（g/mL）、酶用量为 2.0%、酶解温度为55℃、酶作用时间4.0 h，氨基酸态氮含量8.2%。③枯草芽孢杆菌中性蛋白酶：料液比1∶3（g/mL）、酶用量为2.0%、酶解温度为40℃、酶作用时间4.0 h，氨基酸态氮含量最高为4.27%。

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