小儿特发性心肌病91个心肌病相关基因检测分析

张力力 王树水 辛颖 张智伟 李渝芬

1南方医科大学（广州 510515）；2广东省人民医院，广东省医学科学院，广东省心血管病研究所心儿科（广州 510080）

特发性心肌病是原发于心肌病变的心脏结构和功能的异常，包括扩张型心肌病（dilated cardio⁃myopathy，DCM）、肥厚型心肌病（hypertrophic car⁃diomyopathy，HCM）、左室心肌致密化不全（left ventricular noncompaction，LVNC）等。DCM表现为心脏扩大，心室收缩功能减退，伴或不伴有充血性心力衰竭，常有心律失常，可伴发栓塞、猝死等并发症。HCM是以不能解释的心室肥厚为特征的心肌疾病，早期伴心脏舒张功能不全，晚期收缩功能亦受影响，左室流出道梗阻是该病的常见特征，它是最常见的年轻人心源性猝死的原因之一。LVNC是以心室内疏松的肌小梁和深陷的隐窝为特征的心肌病，常累积左室，又称海绵状心肌、窦状心肌持续状态等。近年来，随着二代测序技术的发展，从基因层面诊断疾病，分析基因突变与临床表型的关系已成为研究热点［1］。本文对我院接诊的43例无血缘关系的特发性心肌病儿科患者进行心肌病相关基因进行研究，系首次对特发性心肌病患儿进行多达91个心肌病相关基因的测序分析，以明确特发性心肌病患儿致病基因及其突变特点，初步分析基因突变与临床表型的关系，探讨基因突变在心肌病诊断、预后判断、指导治疗方面的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 广东省人民医院从2015年1月至2017年3月共收治43例无血缘关系心肌病患儿（DCM 14例，HCM12例，LVNC17例），全部病例经酶学及串联质谱检查等排除代谢性心肌病，经临床、超声心动图检查确诊。DCM中，男8例，女6例，年龄0.3～14（6.4±5.4）岁。HCM中，男4例，女8例，年龄0.3～14（6.3±4.9）岁。LVNC中，男7例，女10例，年龄0.2±13（4.0±4.5）岁。本研究经广东省人民医院医学研究伦理委员会批准，所有患儿及直系亲属，均由其本人或监护人签署知情同意书。

1.2 基因测序分析

1.2.1 二代基因测序 抽取静脉血2 mL，采用QIAamp DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）抽提基因组DNA。提取的DNA用DNA酶片段化后用磁珠法进行纯化，随后进行PCR扩增并连接上接头序列，使用 TruSight One Sequencing Panel（illumina Inc，USA）试剂盒经2次捕获及纯化，再经PCR扩增和纯化后获得的最终文库在Nextseq500测序仪（illumina Inc，USA）上进行外显子区及外显子与内含子交接区的二代测序。

1.2.2 数据分析 根据既往文献报道［2-4］和HGMD（Human Gene Mutation Database）、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Men）等数据库选取与心肌病相关或可能相关的91个基因进行分析。该91个基因为 AARS2、ABCC9、ACTC1、ACTN2、AGK、ANKRD1、BAG3、CALR3、CASQ2、CAV3、CHRM2、COX15、 CRYAB、 CSRP3、 CTF1、 DES、 DMD、DNAJC19、DOLK、DSC2、DSG2、DSP、DTNA、ELAC2、EMD、EYA4、FHL1、FHL2、FKTN、FLT1、FOXD4、FXN、GATAD1、GLA、ILK、ISL1、JPH2、JUP、KLF10、LAMA2、LAMA4、LAMP2、LDB3、LMNA、MAP2K2、MRPL3、MTO1、MURC、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYO6、MYOM1、MYOZ2、MYPN、NDUFAF1、NDUFS7、NEBL、NEXN、PDLIM3、PKP2、PLN、PRKAG2、PSEN1、PSEN2、RBM20、RYR2、SCN5A、SGCA、SGCD、SLC25A3、SLC25A4、SRI、SYNE1、SYNM、TAZ、TCAP、TGFB3、TMEM43、TMPO、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、TXNRD2、VCL。用BWA算法比对到参考序列（UCSC hg19），采用仪器默认设置，使用ANNOVAR工具对数据进行注释。使用千人基因组计划数据库、ESP6500数据库、HGMD数据库进行筛选、注释；使用SIFT、Polyphen⁃2软件进行错义变异的生物信息学分析。综合各个基因变异的频率、基因功能、遗传方式、文献报道等信息，并结合患儿的临床表型信息，筛选候选突变。根据2015年“美国遗传学与基因组学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）”提出的指南得出致病性判断，基因突变的致病性程度分为5档，即致病突变、可疑致病突变、临床意义未明、可能无害、无害［5］。

1.2.3 Sanger测序验证 针对候选突变的位点，用Primer Premier 5.0软件设计引物，对其中收集到静脉血的一代亲属进行相应位点的Sanger测序验证。

2 结果

2.1 特发性心肌病基因突变情况 43例患儿（DCM 14例，HCM 12例，LVNC 17例）中，20例（46.5%）检测到 ACTC1、DSG2、ELAC2、FKTN、HCN4、LAMA2、LMNA、MTO1、MYBPC3、MYH6、MYH7、NEBL、NEXN、NKX2⁃5、PLN、PSEN2、RAF1、SCN5A、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、VCL等 23个基因上的致病突变和可疑致病突变，共检测到28个致病突变或可疑致病突变位点，未见有重复出现的突变位点（表1）。其中6例患儿同时检测到2个基因上致病突变或可疑致病突变，2例患儿同时检测到1个基因的2个致病突变或可疑致病突变。对其中24个突变位点进行父母测序验证发现，由父或母遗传的有19个，新发突变5个。致病突变和可疑致病突变中，突变方式以错义突变为主，占50.0%，其次为移码突变（17.8%）、无义突变（14.3%）、剪接突变（10.7%）、外显子和内含子交接区的微小缺失突变（3.5%）。此外，19例（44.1%）患儿检测到临床意义未明的突变位点。

2.2 DCM与基因突变 14例DCM患儿中，5例（35.7%）检测到7个基因上的8个致病突变及可疑致病突变位点，余9例均检测到临床意义未明的突变。1例DCM患儿中检测到FKTN基因上的2个位点的突变，FKTN⁃L166P来自于父亲，FKTN⁃F369fs来自于母亲，父母均无心脏扩大或心力衰竭的表现，但该患儿就诊时即有严重的心力衰竭。

2.3 HCM与基因突变 12例HCM患儿中的7例（58.3%）检测到10个基因上的11个致病及可疑致病突变位点，3例检测临床意义未明的突变。对其中1例有晕厥史，且就诊2年后因心力衰竭死亡的患儿（病例17，图1）进行家系分析发现，其母亲、妹妹、外婆携带致病突变MYH7⁃R663C，其父亲、伯父携带可疑致病突变MYH7⁃R1050*，均未患病，其姐姐诊断为HCM已于4岁猝死，未能检测到其姐姐基因。1例患儿父亲不明原因猝死，后发现该患儿心肌肥厚且检测到致病突变TNNT2⁃R130C，患儿母亲未携带此突变。还有1例HCM患儿检测到PKP2基因上的R284G位点突变，该位点根据ACMG指南判断为临床意义未明，但通过患儿家系验证发现，该位点为新发突变，其父、母均未携带此突变位点。

表1 特发性心肌病基因型与临床表型Tab.1 Genotype and phenotype of cadiomyopathy

2.4 LVNC与基因突变 在17例LVNC的患儿中，8例（47%）检测到9个基因上的9个致病及可疑致病突变位点。7例检测到临床意义未明的突变，2例患儿仅检测到无害和可能无害的突变位点。对1例（病例9，图2）患儿进行家系分析发现，该患儿携带的突变ACTC1⁃c.616+1G＞C为新发突变，其兄长、父、母均不携带此突变。1例合并有窦性心动过缓的患儿检测到致病突变HCN4⁃G482R。

3 讨论

本文首次对特发性心肌病患儿进行多达91个心肌病相关基因的测序分析，明确特发性心肌病患儿致病基因及其突变特点，初步分析基因突变与临床表型的关系，探讨基因突变在心肌病诊断、预后判断、指导治疗方面的作用。研究发现DCM与48个基因的突变有关，40%～50%的家族性DCM可以检测到基因突变［6］，其中最常见的突变基因为TTN，约占20%，其次为LMNA（6%），MYH7（4.2%），MYH6（3 ～ 4%），SCN5A（2 ～ 4%）等［7］，本研究中14例DCM患儿中5例检测到致病基因突变和可疑致病突变，大部分为非家族性的DCM，我们检测到常见基因LMNA，还检测到TPM1、VCL、PLN、DSG、PSEN2、FKTN 等致病基因。在HCM中，已经报道了26个致病基因，50%～60%的家族性HCM，20%～30%的非家族性HCM可以检测到基因突变［8］。研究表明在HCM的致病基因中 MYH7、MYBPC3约各占 40%，TNNI3、TNNT2约各占 5%，TPM1约占 2%［9］，本研究在12例HCM患儿中7例检测到致病突变及可疑致病突变。我们也同样检测到MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3上的突变位点，与文献报道相符。此 外 ，还 检 测 到 TTN、RAF1、PSEN2、LAMA2、NEXN、MTO1等基因的突变位点。LVNC与15个基因突变相关，15% ～50%的LVNC为家族遗传［10］。常见的LVNC致病基因有DTNA、MIB1、PRDM16、TNNT2、TAZ等［11］。本研究检测到的致病基因包括 ACTC1、ELAC2、HCN4、LMNA、MYH6、NEBL、NKX2⁃5、SCN5A、TTN。

图1 1例HCM患儿超声心动图及基因测序图Fig.1 Images for a patient of HCM

图2 1例LVNC患儿超声心动图及基因测序图Fig.2 Images for a patient of LVNC

根据既往文献报道和相关数据库选择了与心肌病相关或可能相关的91个基因进行测序分析［1-3］。在本研究的43例特发性心肌病患儿中，20例（46.5%）检测到致病或可疑致病突变位点，19例（44.1%）检测到目前临床意义尚未明确的突变位点。这些研究结果提示，将心肌病相关基因检测用于协助诊断特发性心肌病是可行的。特发性心肌病患儿中大部分都能检测到突变位点，但其中存在临床意义未明的位点，我们的研究结果显示，这些临床意义目前尚未明确的突变位点很可能与患儿的发病密切相关，需要今后进一步的分析。本研究中，1例HCM患儿检测到PKP2基因上的R284G位点突变。虽然根据目前的判断标准，该突变尚定义为临床意义未明的突变位点，但该位点为新发突变，具有较强的致病证据，很可能与HCM发病相关。在既往研究中，PKP2⁃R284位点未见有引起HCM的报道，但PKP2基因的突变影响桥粒功能，是引起右室心肌病的常见致病基因，因而我们怀疑R284G为新发现的HCM的致病位点，需要进行下一步的验证。

文献报道，部分基因突变位点与病变程度相关。有研究结果显示携带一个基因上的双突变位点是患儿预后不良的标志［12-13］。本研究中1例DCM患儿携带FKTN的双突变位点，其分别来自于父母，该患儿父母无心脏扩大或心力衰竭等表现，但患儿就诊时即有严重的心力衰竭，且治疗后未见明显好转，支持其预后不良的特点。另1例HCM患儿携带有MYH7的双突变，她是本研究HCM病例中唯一一例死亡的患者，该患儿10岁时就有胸痛、心衰等表现，12岁因心力衰竭死亡，其姐姐在4岁因HCM猝死，支持文献报道的该类病例具有病情重、预后差的特点。因此，对于检测到一个基因上双突变位点的病例，应密切随访，并早期告知家属其预后情况。HCM中，TNNT2的突变位点R92Q，R92W，R130C等引起的心肌肥厚不严重，但易引发心源性猝死［14］。本研究中检测到的TNNT2⁃R130C的突变的患儿心肌肥厚亦不严重，其母亲未携带此突变，父亲已于30岁猝死，高度怀疑其猝死与此突变相关，该患儿目前无临床症状，但根据其基因型与家族猝死史，临床应予以密切关注，加强随访，必要时应早期应用置入性心脏除颤器预防猝死。MILANO等［15］曾发现HCN4⁃G482R突变的LVNC患者常合并有窦性心动过缓，本研究中有1例LVNC患儿也检测到了HCN4⁃G482R突变，该患儿同样具有显著的心动过缓，而本文中其他LVNC病例均不合并明显的窦性心动过缓。

由于受到研究经费、研究时间等方面的限制，本研究尚有一些突变位点目前未能明确是否致病，突变位点与临床表型的关系也未得到大样本的验证。今后，将对研究病例进行长期随访、扩大样本量，以上述问题进行深入研究。

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