YAP、LPA及TAZ在头颈鳞癌中的表达及其与临床病理特征的关系

杨海波 黄定强 姜粱

1雅安市人民医院耳鼻喉头颈外科（四川雅安 625000）；2西南医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科（四川泸州 646000）

头颈部恶性肿瘤中以鳞癌最为常见，包括鼻咽癌在内，每年均有大量的新发与死亡病例［1］。尽管现代医疗技术飞速发展，减轻了广大病患的痛苦，但无疾病进展时间及总生存时间并无显著提高。该类疾病的发生发展过程、肿瘤侵袭与转移、药物相互作用及耐药机制等都成为当前研究的热点［2］。由于特殊解剖位置和毗邻关系，治疗的各方面限制颇多，病情发展迅速，严重影响患者生存质量。近来研究发现，Hippo⁃YAP信号通路上、下游因子如溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）等异常可能作为一种致癌因素促使多种恶性肿瘤的发生及发展［3］，但在涎腺鳞癌中LPA、Yes相关蛋白（yes⁃associated protein，YAP）及含PDZ结合区的共转录激活因子（transcriptional co⁃activator with PDZ⁃binding motif，TAZ）的相关研究甚少，本课题从术后病理标本层面进行探讨，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 组织标本 选择性收集雅安市人民医院病理科2010年1月至2016年12月期间，手术切除的病理组织石蜡标本共计136例，其中包括头颈鳞癌癌旁正常组织37例、头颈良性瘤样组织35例、头颈鳞癌64例。所有病理组织切片均经2位病理科高年资主治医师以上人员共同确认。患者年龄26～73岁，平均（54.25±7.82）岁，55岁以上者34例，＜55岁者30例；分化由高到低（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级）分别为15、29、20例；TNM分期：Ⅰ～Ⅳ期分别为10、16、20及18例；淋巴结转移有转移36例，未发生淋巴结转移的有28例。

1.2 实验材料 兔抗人LPA、YAP及TAZ抗体（西安依科生物公司）、RIPA蛋白及PMSF裂解液（成都贝斯特试剂技术公司），PMSF、SDS、G250、亚甲基双丙烯酰胺及总RNA提取试剂盒等（上海润洁化学技术有限公司），溴酚蓝（北京兰伯瑞生物科技公司）。

1.3 免疫组化检测 按照LPA、YAP及TAZ免疫组化试剂盒说明操作，采用两步染色法依次包括烘片、脱蜡、抗原修复、消除内源性过氧化物酶活性、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色、脱水、透明、封片及结果判定等。测定各指标在癌旁组织、腺瘤组织和腺样囊性癌组织中表达。在40倍镜下随机选四处视野拍照，经图像分析软件（Image⁃Pro Plus image）对采集的图像行积分吸光度（IOD）分析获取定量数值。

1.4 实时定量PCR（qRT⁃PCR）检测 按LPA、YAP及TAZ mRNA提取试剂盒说明书操作，通过紫外吸收法检测260 nm处吸收峰，计算得到RNA浓度。将胶置于紫外灯下观察凝胶并拍照。引物委托北京奥科生物有限公司设计及合成YAP、LPA及TAZ和内参GAPDH的RT⁃PCR引物。各自对应的双向引物（5′⁃3′）序列：GAPDH，上游：GA GGGAGAAGGTCTGAAT，下游：GATGATGGGGAT GGATTAG；YAP上游：TTGGAGAGTCACAGTACT G，下游：GTTGAAAATGGCCTTGAATA；LPA上游：TAGTCTTCTTGCTCTTAGTGG，下游：TAAGTATCT CGGCAAGAGTA；TAZ上游：CGATCATGTAGCTTG ACTTG，下游：ACCATACTTGTCATCGTCGT。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件包分析所有数据。以表示各指标，组间比较采用Student′st⁃test检验及单因素方差分析，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPA、YAP及TAZ mRNA在头颈部组织中的表达 采用实时qRT⁃PCR法检测LPA、YAP及TAZ mRNA在不同组织中的表达并由GAPDH定量（图1），LPA mRNA在头颈鳞癌癌旁正常组织、头颈良性瘤样组织和头颈鳞癌组织中的表达相近（P＞0.05）。YAP mRNA在鳞癌组织中的表达要高于癌旁组织、瘤样组织中的表达（P＜0.05）。TAZ mRNA在头颈3种组织中呈低表达，但头颈鳞癌组织的表达明显高于良性瘤样组织及癌旁正常组织（P＜0.05）。TAZ mRNA在良性瘤样组织中的表达亦显著高于在癌旁正常组织中的表达（P＜0.05），见表1。

2.2 LPA、YAP及TAZ蛋白在头颈组织中的表达 LPA、YAP及TAZ蛋白在绝大多数组织中都有表达，主要表达在细胞膜和细胞质中，组化方法测定，IOD值分析得出YAP和TAZ蛋白在头颈鳞癌组织中的表达要显著高于在癌旁正常组织和瘤样组织中的表达（P＜0.05）。而LPA在癌旁正常组织、良性瘤样组织和鳞癌组织中蛋白的表达无明显差异（P＞0.05），见表2、图2。

表1 LPA、YAP及TAZ mRNA在头颈组织中的相对表达量的比较Tab.1 Comparison of the relative expression of LPA，YAP and TAZ mRNA in head and neck tissues ±s

表1 LPA、YAP及TAZ mRNA在头颈组织中的相对表达量的比较Tab.1 Comparison of the relative expression of LPA，YAP and TAZ mRNA in head and neck tissues ±s

注：与正常组织比较，*P＜0.05；与良性瘤样组织比较，▲P＜0.05

组别头颈癌旁正常组织头颈良性瘤样组织头颈鳞癌组织例数37 35 64 LPA 0.145±0.032 0.142±0.028 0.143±0.034 YAP 0.154±0.065 0.171±0.086 0.348±0.079*▲TAZ 0.037±0.007 0.053±0.005*0.076±0.006*▲

表2 LPA、YAP及TAZ蛋白mRNA在头颈组织中的相对表达的比较Tab.2 Comparison of the relative expression of LPA，YAP and TAZ mRNA in head and neck tissues ±s

表2 LPA、YAP及TAZ蛋白mRNA在头颈组织中的相对表达的比较Tab.2 Comparison of the relative expression of LPA，YAP and TAZ mRNA in head and neck tissues ±s

注：与正常组织比较，*P＜0.05；与良性瘤样组织比较，▲P＜0.05

组别头颈癌旁正常组织头颈良性瘤样组织头颈鳞癌组织例数37 35 64 LPA 0.420±0.023 0.485±0.035 0.520±0.037 YAP 0.460±0.055 0.478±0.066 0.655±0.060*TAZ 0.284±0.038 0.372±0.036*0.585±0.035*▲

图2 LPA、YAP及TAZ蛋白在不同头颈组织中的表达（×40）Fig.2 LPA,YAP and TAZ protein expression in different head and neck tissues（× 40）

2.3 LPA、YAP及TAZ表达在头颈鳞癌中的表达与患者临床病理特征相关性 LPA、YAP及TAZ的表达与头颈鳞癌患者临床病理因素相关性研究中发现，LPA的表达与头颈鳞癌病理特征无显著相关性；鳞癌组织YAP表达在肿瘤＞3.0 cm、淋巴结阳性中高于肿瘤≤3.0 cm、淋巴结表达阴性（P＜0.05）；TAZ的表达在肿瘤中低分化、肿瘤＞3.0 cm、淋巴结阳性及Ⅲ～Ⅳ期显著高于肿瘤高分化、肿瘤≤3.0 cm、淋巴结阴性及Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05），见表3。

3 讨论

头颈部肿瘤中鳞癌（squamous cell carcinoma of head and neck，SCCHN）占 90%［1］，包括喉咽、口腔、鼻咽及下咽癌等，全球每年新发65万以上。由于特殊解剖位置与比邻关系给治疗带来一定困难。探讨头颈鳞癌相关的分子标志物，为肿瘤的诊断及靶向治疗提供思路［4］。LPA是一种存在于唾液和血液并具有多种生物活性的甘油磷脂，能促进细胞的增殖、迁移和侵袭［5］。YAP及同源基因——TAZ作为Hippo通路的下游效应分子，通过核内调控基因表达促进肿瘤发生、发展［6］。YAP与TAZ为同源蛋白，二者在结构及生物学功能方面高度一致，在多种肿瘤如胰腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤细胞中都观察到高表达［7］，然而在涎腺肿瘤报道甚少。因头颈肿瘤以鳞癌居多，我们通过分子生物学检测及临床病理分析，以探讨YAP与TAZ在头颈鳞癌中所发挥的作用与相关性。

表3 LPA、YAP及TAZ在鳞癌中的表达与临床病理特征的关系Tab.3 LPA，YAP and TAZ expression in squamous cell carcinoma were related to clinicopathological features ±s

表3 LPA、YAP及TAZ在鳞癌中的表达与临床病理特征的关系Tab.3 LPA，YAP and TAZ expression in squamous cell carcinoma were related to clinicopathological features ±s

注：与阴性组比较，*P＜0.05

例数（%）LPA YAP TAZ临床特征年龄（岁）＜55≥55性别34（53.13）30（46.87）0.125±0.041 0.126±0.038 0.167±0.045 0.162±0.056 0.053±0.018 0.057±0.021男女42（65.62）22（34.38）0.145±0.034 0.147±0.036 0.158±0.037 0.161±0.034 0.037±0.018 0.038±0.020抽烟是否48（75.00）26（25.00）0.124±0.042 0.131±0.038 0.178±0.053 0.184±0.064 0.049±0.026 0.053±0.023饮酒是否27（42.19）37（57.81）0.147±0.025 0.151±0.028 0.191±0.046 0.187±0.052 0.043±0.019 0.039±0.017临床分期Ⅲ～ⅣⅠ～Ⅱ病理分期中低分化高低分化肿瘤大小（cm）＞3.0≤3.0淋巴结转移阳性阴性26（40.63）38（59.37）0.154±0.037 0.162±0.041 0.172±0.052 0.181±0.060 0.067±0.019*0.042±0.016 23（35.94）41（64.06）0.154±0.037 0.146±0.041 0.167±0.055 0.164±0.049 0.058±0.032*0.031±0.029 30（46.88）34（53.12）0.129±0.027 0.132±0.033 0.287±0.060*0.159±0.056 0.069±0.026*0.047±0.031 28（43.75）36（56.25）0.142±0.034 0.135±0.035 0.369±0.048*0.182±0.045 0.065±0.019*0.043±0.022

本研究发现TAZ mRNA在头颈3种组织中呈低表达，由高到低依次为癌组织、良性瘤样组织及癌旁正常组织，TAZ的表达在肿瘤中低分化、肿瘤＞3.0 cm、淋巴结阳性及Ⅲ～Ⅳ期高于肿瘤高分化、肿瘤≤3.0 cm、淋巴结阴性及Ⅰ～Ⅱ期。AASRUM等［8］探讨TGF、EGF信号对LPA诱导口腔鳞癌细胞增殖的影响发现LPA诱导的口腔鳞癌SAS细胞的增殖与EGFR活化信号有关，而与LPA诱导的TGF⁃β活化无关。DONG等［9］对口腔鳞癌患者癌标本及临床病理资料相关性分析，认为TAZ阳性表达与肿瘤大小、肿瘤组织分化程度、淋巴结有无转移有关，Hippo信号通路参与口腔鳞癌的发生、发展。TAZ、P⁃TAZ等蛋白与口腔鳞癌的预后情况相关。CHEN等［10］通过免疫组化及细胞培养探讨YAP的表达及与神经酰胺作用，发现YAP蛋白在涎腺鳞癌组织中有较明显的表达，而在癌旁正常组织中并无明显的表达，由此说明YAP表达与涎腺鳞癌密切相关，胞核YAP蛋白的检测可考虑作为涎腺鳞癌细胞生物标记或未来靶向治疗的靶标。QIU等［11］通过检测喉癌及声带息肉组织YAP表达，发现YAP表达主要存在于喉癌和声带息肉组织的细胞核，而磷酸化的YAP多表达细胞质，喉癌组织中的表达显著高于声带息肉，且YAP表达水平与喉癌的恶性程度、病理类型、淋巴结转移和临床分期呈正相关，由此说明YAP作为癌基因可能参与喉癌发生、发展。本课题研究YAP和TAZ蛋白在头颈鳞癌组织中的表达要显著高于在癌旁正常组织和瘤样组织中的表达；且在鳞癌中的表达与肿瘤分化程度、T分期、N分期等密切相关。GE等［12］通过免疫组化及组织芯片技术检测YAP在人涎腺良性疾病及鳞癌组织标本中的表达，结果发现癌组织中表达显著高于良性，且YAP在进展期涎腺鳞癌及转移灶中显著高表达，这也印证了本课题的实验。

综上所述，本研究探讨YAP、LPA及TAZ在头颈鳞癌中的表达及其与临床病理意义，认为YAP及TAZ在头颈鳞癌中的表达与肿瘤分期、分化程度、淋巴结发生发展密切相关，但作用机制、信号通路等方面的研究尚欠缺，将是头颈鳞癌未来分子诊断、靶向治疗深入研究的方向。

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