呼吸道合胞病毒感染患儿外周血单个核细胞Toll 样受体的表达及意义

李 珂

呼吸道合胞病毒是引发全球范围内小儿急性下呼吸道感染的主要病原体，毛细支气管炎和肺炎等是由其引发的常见疾病类型，诊治不及时将引发呼吸衰竭甚至死亡，有数据报告显示全球每年有7～20 万例5 岁以下儿童死于急性下呼吸道感染，带给家庭及社会沉重的经济负担[1]。呼吸道合胞病毒主要侵袭患儿呼吸道，诱导呼吸道上皮细胞分泌细胞因子及趋化因子等炎症因子，引发器官以及支气管痉挛等气道高反应性，从而危害婴幼儿生命健康[2]。Toll 样受体（TLRs）是连接天然免疫以及获得性免疫的模式识别受体，能特异性地识别来源于特定类型微生物中保守结构的分子，通过对细胞信号传导途径进行激活，从而激活固有免疫反应，在机体建立特异性免疫中发挥重要作用[3]。有文献报告指出TLRs 在代谢综合征患者、慢性乙型肝炎患者中发挥重要作用[4]，国外学者研究则表明TLRs 及其信号通路在宿主感染呼吸道合胞病毒后发挥着重要作用[5]，本研究旨在探讨呼吸道合胞病毒感染患儿外周血单个核细胞（PBMCs）上TLRs 的表达及意义。

1 材料与方法

1.1 病例资料 以2016年3月～2018年3月我院收治的65例呼吸道合胞病毒感染患儿（记为观察组）和同期在我院体检的35例健康儿童（记为健康组）为研究对象，患儿纳入标准：①患儿入院后经呼吸道分泌物检测提示呼吸道合胞病毒抗原阳性；②年龄≤12 岁；③未合并先天性心脏病、免疫缺陷及支气管发育不良等疾病。排除标准：伴有细菌或衣原体等其他病原体感染者。健康儿童纳入标准：①年龄≤12 岁；②既往无呼吸道合胞病毒感染史；③既往无细菌或衣原体等病原体感染史。观察组65例，男36例，女29例，年龄4～12 岁，平均（7.26±2.03）岁；健康组35例，男19例，女16例，年龄4～11 岁，平均（8.01±2.01）岁。两组性别、年龄基线资料相比较无明显差异（P＞0.05），有可比性。

1.2 研究方法 ①临床资料收集：采用我院自制调查问卷对纳入研究对象的临床资料进行调查，主要调查纳入对象性别、年龄、体质指数（BMI）、炎症因子[白介素-6（IL-6）、白介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α），采用放射免疫分析法检测IL-6、IL-17；双抗体夹心法检测TNF-α 水平，试剂由福建迈特生物工程有限公司提供]水平。②外周血单个核细胞制备：采集纳入研究对象外周血，采用肝素抗凝，密度梯度进行离心以获得PBMCs，将其悬浮于1640 培养基(由10%的胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、L-谷氨酰胺1.5mM组成)，最后调整细胞浓度为1×106/ml，采用台盼蓝实验评估细胞存活状态(＞98%)。③外周血单个核细胞中TLRs 检测，外周全血肝素抗凝，红细胞裂解液加入，10min 后离心，1ml PBS 液重复洗涤细胞两次，每管加入20μl PE 标记的鼠抗人TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 单抗(由北京中山生物公司提供)，混匀后室温遮光孵育0.5h，PBS 洗涤液洗涤一次后，将荧光染色的细胞离心沉淀，每只管内加入多聚甲醛固定10min 后，将其放在4℃处保存待用，离心后将上清液去掉，采用PBS 液对细胞密度进行调整，最终调整为2×109/L；采用 TR Lzol 法提取细胞总RNA，依据反转录试剂盒说明书操作步骤将RNA 反转录为cDNA，适当比例稀释后，行荧光定量PCR 扩增，内参物为GAPDH，反应条件:95℃各10min、15s，55 ℃1min，72 ℃10s，共重复38个循环；TLR 相对表达量以TLR 与内参物GAPDH 表达量的比值进行表示；每个样本设3 个重复孔，取平均值，引物（上海生工合成）序列：TLR-3上游引物5'-GCCTCTCCAAGGAAGAATCC-3'，下游引物5'-TCCTGTTGTTGGACAGGTCA-3'；TLR-4 上游引物5'-AATCTAGAGCACTTGGACCTTTCC-3'，下游引物5'-GGGTTCAGGGACAGGTCTAAAGA-3'；TLR-7上游引物 5'-AAGAAAGGTTCCCGCAGACTT-3'，下游引物5'-TGTTATGGCATAGAATCAAAACTCTCA-3'；TLR-9 上游引物 5'-GGACCTCT-GGTACTGCTTCCA-3'，下游引物5'-AAGCTCGTT-GTACACCCAGTCT-3'；GAPDH上游引物5'-AGAAGGCTGGGCTCATTTG-3'，下游引物 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0 软件分析处理研究数据，计量资料以±s 表示，组间对比行独立样本t 检验，计数资料以率（%）表示，组间对比行χ2检验，符合正太分布计量资料间行Pearson 相关性分析，数据间回归分析采用多元Logistic 回归分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。均行双侧检验。

2 结果

2.1 两组临床资料比较 两组性别、年龄、BMI 相比无明显差异（P＞0.05）；观察组IL-6、IL-17、TNF-α较健康组明显高，差异显著（P＜0.05），见表1。

2.2 两组PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 的表达水平 观察组PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 表达水平较健康组明显高，差异显著（P＜0.05），见表2。

2.3 观 察 组TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 与 临 床指标的相关性分析 以呼吸道合胞病毒感染患儿PBMCs TLRs 为应变量，以年龄、性别、BMI、IL-6、IL-17、TNF-α 等为自变量，进行多元逐步回归分析，IL-6、IL-17、TNF-α 代入回归方程（P＜0.05），常数项为0。相关性分析提示呼吸道合胞病毒感染患儿IL-6、IL-17、TNF-α 水平与TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 表达水平均呈明显正相关（P＜0.05），而患者性别、年龄、BMI 与TLR3、TLR4、TLR7、TLR9无明显相关性（P＞0.05），见表3。

表1 两组临床资料比较（±s）

项目 + 观察组（n=65）健康组（n=35） t/χ2 P性别（男/女） 36/29 19/16 0.011 0.916年龄（岁） 7.26±2.03 8.01±2.01 1.768 0.080 BMI（kg/m2） 16.98±3.05 17.01±3.08 0.047 0.963 IL-6（ng/L） 315.26±24.14 102.31±32.87 36.955 0.000 IL-17（ng/ml） 321.62±31.13 192.58±19.18 22.319 0.000 TNF-α（ng/L） 25.16±6.12 2.87±1.01 21.343 0.000

表2 两组PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 的表达水平（±s）

表2 两组PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 的表达水平（±s）

组别 TLR3 TLR4 TLR7 TLR9观察组（n=65）0.13±0.04 0.14±0.05 0.15±0.05 0.16±0.06健康组（n=35）0.07±0.02 0.08±0.02 0.07±0.03 0.08±0.03 t 8.318 6.800 8.652 7.394 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 观察组TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 与临床指标的相关性分析

3 讨论

呼吸道合胞病毒是有胞膜非片段的单股负链RNA 病毒，常侵袭儿童的呼吸道，其发病机制为呼吸道合胞病毒通过诱导呼吸道上皮细胞分泌细胞因子以及趋化因子等炎症因子，引发气管以及支气管痉挛最终导致气道高反应，呼吸道合胞病毒是目前引发婴幼儿下呼吸道感染的常见病原体[6]；而TLRs 是目前临床中用以连接天然免疫及获得性免疫的模式识别受体，其可激活细胞信号通路途径和机体固有免疫反应[7]，有研究指出TLRs 在宿主感染呼吸道合胞病毒中发挥重要作用[8]，临床积极探究呼吸道合胞病毒感染患儿PBMCs TLRs 的表达及意义，为防治儿童呼吸道合胞病毒感染性疾病提供理论依据。本研究结果发现：观察组IL-6、IL-17、TNF-α 较健康组明显高，观察组PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 表达水平较健康组明显高，相关性分析提示呼吸道合胞病毒感染患儿IL-6、IL-17、TNF-α 水平与TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 表达水平均呈明显正相关，IL-6、IL-17、TNF-α、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 在呼吸道合胞病毒感染患儿中发挥着重要作用。

TLRs 为Ⅰ型跨膜受体蛋白，主要包含胞外区、跨膜区以及胞内区组成，而TLRs 的胞内区与IL-1R 家族各成员胞内区同源，有200 多个氨基酸组成，称为Toll/IL-1 受体结构域（TIR 结构域），TIR有嗜同性相互作用，是TLRs 向下游进行信号传递的枢纽[9]；本研究结果提示呼吸道合胞病毒感染患儿炎症因子IL-6、IL-17、TNF-α 与TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 呈明显正相关，表明TLRs 在呼吸道合胞病毒感染患儿中发挥重要作用，呼吸道合胞病毒感染在转录及翻译过程中可产生大量的双链RNA，可特异性地被TLR3 识别，早期文献报道指出通过TLR3 激活的嗜酸性粒细胞可募集白细胞聚集于炎症部位，此外TLR3 在过敏性鼻炎以及过敏性气道炎症中呈弱表达，可推断TLRs 在呼吸道合胞病毒感染中发挥重要作用[10]。呼吸道合胞病毒感染可引发TLR4 表达量明显升高，在增强呼吸道上皮细胞对脂多糖的敏感性中发挥重要作用，机体上皮细胞感染呼吸道合胞病毒后，TLR4 的信使RNA 及蛋白表达明显上调，与之相关的炎症因子水平也随之明显升高，早期研究也证实TLR4 及其信号通路可能参与了呼吸道合胞病毒诱导的上皮细胞急、慢性炎症反应[11]。TLR7 对感染呼吸道合胞病毒后的免疫效应与TLR3 是类似的，两者都可上调信使RNA及其蛋白表达，既往动物实验研究也表明TLR7 作用的小鼠其炎症因子IL-23 和IL-12 水平明显升高[12]，这也证实了TLR7 在呼吸道合胞病毒感染疾病发生中有重要作用。而TLR9 同样参与了呼吸道合胞病毒感染过程中，其可上调感染呼吸道合胞病毒者TNF-α 水平，引发炎症性疾病，这与既往文献报道相符[13]。由本次研究结果我们可推测TLRs 在启动宿主细胞对病毒的固有免疫、调节机体建立特异性免疫中作用显著，机体感染呼吸道合胞病毒可与不同TLRs 特异性结合，诱导下游炎症因子等的分泌，引发炎症性疾病[14]。

综上所述，PBMCs TLRs 的表达在呼吸道合胞病毒感染性疾病中发挥重要作用，为呼吸道合胞病毒感染患儿新型治疗药物的开发提供参考信息。