山黧豆种子萌发特异性蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

曲瑞红， 刘凤娟， 毕春晓， 宋瑶瑶， 胡 鑫， 徐全乐

(西北农林科技大学生命科学学院， 陕西 杨凌712100)

山黧豆(Lathyrussativus)，又叫家山黧豆，是山黧豆属187种作物中的唯一栽培品种[1-2]。因为其良好的固氮能力、较高的蛋白含量、广谱的抗逆性等优良生物学特征而成为干旱、半干旱地区重要的食用和饲用作物[3-5]。然而，内源毒素β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid,β-ODAP)的存在极大的限制了其推广应用价值[6-7]。在山黧豆发育过程中，β-ODAP的合成与积累有两个明显的高峰：一个在种子萌发期，一个在种子成熟期[8]。代谢组学的研究表明，β-ODAP的积累与氮代谢、硫代谢、嘌呤代谢和嘧啶代谢等基础代谢途径密切相关[9]。尤其是尿嘧啶降解产生的β-丙氨酸可能是β-ODAP含量的调控信号[9]。

在种子萌发过程中，蛋白酶参与了储藏蛋白水解等多种生理过程，为植物的生长发育提供氮源并在种子萌发的生化机制中扮演重要作用[10-12]。目前，许多重要的蛋白酶类已经得到了纯化和鉴定[13-15]。例如，Jamir和Seshagirirao[16]从卡萨蒙纳姜块根中分离了一种半胱氨酸蛋白酶并对其生化性质和抗氧化特征进行了研究；Asano等[13]从大豆子叶分离了两个半胱氨酸蛋白酶D3-α和β。在山黧豆中，Rajyalakshmi[17]发现金属蛋白酶在干种子中活性较高，但在萌发种子中活性较低。Ramakrishna等[15]从山黧豆干种子中纯化和鉴定了Zn2+依赖型的金属蛋白酶。由于种子萌发过程中β-ODAP的大量积累与氮源密切相关，而蛋白酶类在储藏蛋白的水解及氮源的提供中扮演重要作用，因而山黧豆种子萌发特异性蛋白酶的分离纯化及性质研究对于加深β-ODAP积累的理解就显得极其重要。

本研究拟检测山黧豆种子萌发过程中的蛋白酶活性变化，并采用盐析和离子交换层析等方法对蛋白酶进行分离纯化。在此基础上，分析不同金属离子、pH、温度及底物对蛋白酶活性的影响，为进一步研究蛋白酶活性与β-ODAP积累的关系奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 不同萌发时间山黧豆种子蛋白酶提取及明胶酶谱法检测

取山黧豆(Lathyrussativus)干种子50粒，室温浸泡2 h后于30℃，黑暗条件下萌发。分别取干种子及2，4，6，8，10 DAS(days after sowing)萌发种子200 mg于1 mL Tris-HCl(50 mM，pH7.0，含100 mM NaCl，1 mM EDTA)缓冲液中研成匀浆(冰浴)。室温浸提20 min后，4 000 rpm×5 min取上清，利用考马斯亮蓝G250法检测蛋白含量。

采用明胶酶谱法检测上述提取蛋白酶活性[18]。向等蛋白量上述各样品中加入2×SDS上样缓冲液，并配置含0.04%明胶(Bio-Rad，USA)的10%聚丙烯酰胺凝胶，于4℃进行SDS-PAGE电泳(含β-巯基乙醇，上样前无热变性)。用蒸馏水洗涤凝胶2次以除去SDS，每次5 min；再将其置于pH5.5的柠檬酸磷酸缓冲液(含180 mM NaCl，2 mM DTT)中，30℃温育过夜。凝胶经进一步考染、脱色后，用凝胶成像系统(Omega Lum G，Aplegen)观察、记录，并使用Quantity one 4.52对蛋白酶相对活性进行定量分析。

1.2 Ks分段盐析

取山黧豆萌发6 d种子35 g，加50 mM Tris-HCl(pH7.0，含100 mM NaCl)100 mL研磨成匀浆。4℃，10 000 g×20 min后取上清测量体积并用纱布过滤，采用0～40%饱和度的NH4SO4(27.12 g)进行盐析。15 min后，4℃，10 000 g×20 min，得沉淀1。上清测量体积后采用40～80%饱和度的NH4SO4(25.8 g)进行分段盐析，操作同上述。4℃，10 000 g×20 min得沉淀2。沉淀1和2分别用10 mL 1×透析缓冲液(pH 7.0，40 mM磷酸钠缓冲液，2 mM EDTA)溶解并注射到透析盒(Slide-A-Lyzer 3.5K，Thermo Scientific)。透析盒经薄膜封口，置于透析缓冲液中搅拌过夜。所有操作均在冰浴上进行。

从透析盒分别抽取上述溶液，置于15 mL离心管中，4℃，8 000 g×15 min。取上清经12%SDS-PAGE和明胶酶谱法检测，其余备用。

1.3 离子交换层析

采用二乙氨基乙基纤维素(Diethylaminoethyl Cellulose)DE52(Whatman)装柱，用60 mL透析缓冲液洗柱，平衡。上样后用500 mM NaCl梯度洗脱并收集组分。各组分用明胶酶谱法(不含β-巯基乙醇，上样前无热变性)检测蛋白酶纯化情况。

1.4 Proteinase酶活的影响因素测定

用0～100 mg·L-1酪氨酸做标准曲线。参考Kembhavi等[19]方法检测山黧豆蛋白酶活性，略有修改。将50 μL酶液添加到950 μL Tris-HCl(pH8.0，含2 mM CaCl2和0.5% 干酪素)，37℃温育1 h后用0.5 mL TCA(20%)终止反应。室温放置15 min后，13 000 g离心15 min，取上清在波长280 nm下测吸光度值。以水代替酶液设置对照，每个反应设三个重复。以每分钟释放1 mM Tyr为一个酶活单位(U)。

用1 mM EDTA，EGTA，尿素(Urea)及不同金属离子CaCl2，CoCl2，FeCl3，MgCl2，MnCl2，ZnCl2等处理酶液，或利用不同pH(4～11)，不同温度(30，40，50，60，70℃)，不同底物种类(牛血清白蛋白、干酪素、明胶、血红蛋白、奶粉)等检测山黧豆蛋白酶活性。

2 结果与分析

2.1 山黧豆种子萌发过程中蛋白质降解与蛋白酶活性检测

利用10% SDS-PAGE分析山黧豆萌发不同时期的种子可溶性蛋白特征显示：随着萌发时间的延长，山黧豆高分子质量蛋白质(>31 KD)含量显著降低，而较低分子质量蛋白质(≤31 KD)含量显著增加(图1A)。这说明在山黧豆种子萌发的过程中伴随着高分子质量蛋白质的逐步水解。但是在萌发过程中可溶性蛋白含量变化不大。

进一步利用明胶酶谱法检测山黧豆不同萌发时期种子蛋白酶活性显示：除干种子外，不同萌发时期的山黧豆种子蛋白在聚丙烯酰胺凝胶蓝色背景上均呈现透亮条带，位于97 KD处(图1B)。条带亮度观察及Quantity one定量分析表明，山黧豆种子在不同萌发时期(2～10天)的蛋白酶活性基本一致。这说明在山黧豆种子的萌发过程中伴随着蛋白酶的激活，并造成了高分子质量蛋白质的逐步水解和低分子质量蛋白的积累。

图1 不同萌发时期山黧豆种子可溶性蛋白(A)及蛋白酶活性(B)的电泳分析Fig.1 Soluble protein (A) and protease activity (B) analysis of Lathyrus sativus seeds with different days after sowing注：M：蛋白质分子质量标准，1：干种子，2：2 DAS，3：4 DAS，4：6 DAS，5：8 DAS，6：10 DASNote:M:protein molecular weight markers,1:dry seed,2:2 DAS,3:4 DAS,5:8 DAS,6:10 DAS

2.2 山黧豆种子蛋白酶的纯化

取萌发6 d的山黧豆种子提取可溶性蛋白，采用0～40%和40～80%饱和度的NH4SO4进行分段盐析。SDS-PAGE结果表明，大于31 KD的较高分子质量蛋白质在0～40%饱和度条件下析出较多，而小于31 KD的较低分子质量蛋白质在40～80%饱和度条件下析出较多(图2A)。这说明对Ks盐析法而言，相对分子质量越大的蛋白质越容易沉淀。因而，山黧豆蛋白酶在0～40%饱和度条件下更有可能析出；进一步明胶酶谱检测也表明0～40%饱和度条件下析出的蛋白酶活性更高，大约占蛋白酶总活性的65%(图2B)。

图2 分段盐析的SDS-PAGE(A)和明胶酶谱法(B)检测Fig.2 Analysis of the products after fractional salting out with SDS-PAGE (A) and SDS-gelatin-PAGE (B)注：A：15% SDS-PAGE，B：12%SDS-PAGE。M：蛋白质分子质量标准；1，3，5：0～40%饱和度，2，4，6：40～80%饱和度；1～2：5 μL，3～4：10 μL，5-6：15 μLNote:A:15% SDS-PAGE,B:12% SDS-PAGE. M:protein molecular weight markers,1,3,5:0～40% NH4SO4 saturation,2,4,6:40～80% NH4SO4 saturation;1～2:5 μL，3～4:10 μL，5～6:15 μL

取上述0～40% NH4SO4饱和度盐析蛋白，通过DE52阴离子交换柱层析进行进一步的分离纯化。明胶酶谱分析显示，在聚丙烯酰胺凝胶不含β-巯基乙醇时，蛋白酶条带迁移率明显变大(图3)。说明山黧豆蛋白酶可能含有二硫键，在β-巯基乙醇存在时，二硫键被破坏，蛋白酶形状可能呈现不规则状态，电泳迁移率较小(图1B，图2B)；在无β-巯基乙醇时，蛋白酶结构更为紧密，泳动速度加快(图3)。此外，在未结合蛋白中可见少量蛋白酶条带；但在NaCl梯度洗脱时，蛋白酶条带数目增多且清晰(图3，14～17泳道)。收集上述蛋白酶液，用于进一步检测蛋白酶活性的影响因素。

对于上述纯化蛋白进行总蛋白含量、酶活力、酶比活力等检测表明，经盐析和离子交换两步纯化，山黧豆蛋白酶的纯化倍数为6.58，蛋白得率为7.97%(表1)。略低于山黧豆金属蛋白酶及其他物种半胱氨酸蛋白酶等的纯化效率[15-16]。因而，本研究所获山黧豆种子萌发特异性蛋白酶的分离纯化条件还需要进一步优化。

图3 经DE52阴离子交换柱层析纯化蛋白酶的明胶酶谱检测Fig.3 Analysis of the products after ion exchange chromatography of DE52 with SDS-gelatin-PAGE注：M. 蛋白质分子质量标准，1～10：未结合蛋白，11～22：洗脱蛋白Note:M:protein molecular weight markers,1～10:unbound proteins, 11～22:bound fractions

2.3 山黧豆种子蛋白酶活的影响因素

分别向酶反应液中添加1mM的Ca2+，Co2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+等不同金属离子及蛋白酶抑制剂EDTA，EGTA和尿素等，检测其对山黧豆蛋白酶活力的影响。结果表明，大部分金属离子对酶活力的影响不大，说明山黧豆蛋白酶对金属离子的耐受性较高。值得注意的是，添加Fe3+导致蛋白酶活性的显著增加(图4A)。此外，尿素和EDTA对蛋白酶活性有一定的抑制作用，EGTA则作用不大。

以牛血清白蛋白、干酪素、明胶、血红蛋白和奶粉等为不同底物，检测山黧豆蛋白酶活性变化。结果表明山黧豆蛋白酶对上述底物均表现出较高活性，其中血红蛋白和明胶的活性最高，可能是最适反应底物(图4B)。

取等体积酶液在不同pH条件下测定酶活，结果如图4C所示。山黧豆蛋白酶在pH7时活性最大，但在其他pH条件下也能保持70%以上相对活性，表现出较好的酸碱耐受性。而且蛋白酶活性变化没有表现为平滑曲线，略有起伏，可能是由于所纯化样品由多个蛋白酶混合造成的。

表1 山黧豆蛋白酶的分离纯化Table 1 Purification of proteases from Lathyrus sativus

在不同反应温度下，检测山黧豆蛋白酶活力变化。由图4D可知，蛋白酶在30～70℃范围内活性较高，均能保持90%以上相对活性，其最适反应温度为60℃(图4D)。

3 讨论

目前，仅在野豌豆、荞麦等少数物种的干种子中发现了蛋白酶，但其生理功能尚不明确[10,20]。在种子萌发过程中，蛋白酶则广泛存在，其主要类型是半胱氨酸蛋白酶，在储藏蛋白的水解和转运过程扮演重要作用[10]。大多数植物半胱氨酸蛋白酶都属于papain(木瓜蛋白酶)家族和legumain(豆类天冬氨酸蛋白内切酶)家族[21]。Fischer等[22]在野豌豆中分析了papain家族和legumain家族的表达模式，在种子萌发早期检测到了半胱氨酸蛋白酶的特异表达并参与了球蛋白的降解。本研究利用明胶酶谱法检测了山黧豆种子萌发过程中蛋白酶的特异表达，并通过SDS-PAGE观察和分析了种子萌发过程中高分子质量蛋白质的逐步水解和转运。由山黧豆的缺素培养[8]及代谢组学[9]研究可知，氮/氮代谢是β-ODAP含量的关键影响因素。因而，山黧豆种子萌发特异性蛋白酶作用下的蛋白水解及转运可能与β-ODAP在此过程中的大量积累关联。

图4 不同化合物(A)、反应底物(B)、pH(C)、温度(D)对山黧豆蛋白酶活性的影响Fig.4 Effects of different factors of chemicals (A),substrates (B),pH (C) and temperature (D) on activities of proteases in Lathyrus sativus

4 结论

本研究检测了山黧豆蛋白酶在种子萌发期的特异表达和在该时期种子高分子质量蛋白质水解中的作用，继而从萌发6 d的种子中纯化了该蛋白酶并对其基本酶学性质进行了研究。所获山黧豆蛋白酶的纯化倍数为6.58，得率为7.97%；该蛋白酶对金属离子的耐受性较高，但受Fe3+影响较为显著；此外，山黧豆蛋白酶对血红蛋白和明胶的反应活性最高，其最适反应pH和温度分别为pH7和60℃。本研究为进一步研究山黧豆种子萌发过程中蛋白质水解对其内源毒素β-ODAP积累的影响奠定了一定的基础。