胃腺癌组织长链非编码RNA TUG1表达变化及其与p53蛋白的关系

陈庆勇，王娜娜，曹璋，何双，吴淑华，张骞，李红

(滨州医学院附属医院，山东滨州256603)

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，因其早期症状隐匿，约80%患者发现时已属于进展期。近年来，在胃癌手术治疗、化疗以及放疗方面均取得了较大进展，但胃癌术后5年生存率仍不理想。目前，胃癌已成为危害我国人民群众身体健康的重大公共卫生问题之一[1]。长链非编码RNA(lncRNA)是指转录本超过200个核苷酸的非编码RNA，其本身不编码蛋白。牛磺酸上调基因1(TUG1)是lncRNA的一种，近年研究发现，其在多种恶性肿瘤中异常表达，可能与肿瘤的发生、发展密切相关[2，3]。p53是一种常见的抑癌基因，在调控肿瘤细胞周期过程中具有重要作用。本研究观察了TUG1在胃腺癌组织中的表达变化，并分析其与临床病理特征的关系，进一步分析TUG1表达与p53表达的相关性，从而为胃腺癌的预后评估及治疗寻找新的靶标。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集滨州医学院附属医院2016年1～7月手术切除的胃腺癌组织及其癌旁正常组织(距肿瘤边缘>2 cm)108例份，液氮中保存。标本来源患者男64例、女44例，年龄38～79岁、中位年龄61岁；肿瘤直径2.5～11.0 cm，平均7 cm；临床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期25例，Ⅲ期58例，Ⅳ期13例。所有患者为首诊胃癌，并经组织病理学检查证实为腺癌，且术前未行任何抗肿瘤治疗。本研究经滨州医学院附属医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 主要试剂 TRIzol、cDNA合成试剂盒及定量聚合酶链反应(PCR)试剂均购自美国Invitrogen公司。TUG1上游引物：5′-TCAAGACCTGGACCTGGAAC-3′；下游引物：3′-AGTTTGCACTGAGGGTCTGG-5′。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。所有引物序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。p53单克隆抗体购自福建迈新生物技术有限公司；SP试剂盒及DAB显色试剂均购自北京中山生物技术有限公司。

1.3 胃腺癌组织TUG1检测

1.3.1 RNA提取 从液氮中取出组织，剪取约100 mg，加入TRIzol 1 mL，用匀浆器匀浆。将匀浆后样品置于25 ℃水浴锅中孵育5 min，以便核酸蛋白复合体完全解离，其余步骤参照试剂盒说明书进行。

1.3.2 RNA浓度和纯度测定 取RNA样品2 μL，用1×TE缓冲液稀释10倍，测定样品在260、280 nm波长处的吸光度(A)值。RNA浓度=A260×稀释倍数×40 ng/μL。A260/A280为1.8～2.1，表明提取的RNA质量合格，符合后续实验要求。

1.3.3 cDNA合成 取RNA 0.8 μg、0.5 μg/μL Oligo(dT)18 1 μL、2.5 mmol/L dNTPs Mix 1.6 μL，加无RNA酶的H2O至总体积14.5 μL。将混合液置于65 ℃水浴5 min,冰上放置2 min。短暂离心后，在离心管中依次加入RT反应液5×First-Strand Buffer 4 μL、0.1 mol/L DTT 1 μL、RNase ihibitor 0.3 μL、SuperScript Ⅲ RT 0.2 μL，37 ℃恒温静置1 min；混匀，依次50 ℃温育60 min、70 ℃温育15 min，获得cDNA待用或置于-20 ℃保存。

1.3.4 实时荧光定量PCR 将所有cDNA样品分别配置real-time PCR反应体系。PCR反应体系：2×Master Mix 5 μL，10 μmol/L PCR特异性上下游引物各0.5 μL，加H2O至总体积8 μL。轻弹管底，使溶液充分混合，5 000 r/min短暂离心，转入PCR反应管内；再加入cDNA 2 μL，然后进行real-time PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 60 s共40个循环；扩增反应结束，95 ℃ 10 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s，并从60 ℃缓慢加热至99 ℃。采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量，其中高于均值为高表达、低于均值为低表达。

1.4 胃腺癌组织p53表达检测 采用免疫组化法。标本全部经4%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规制片，按免疫组化SP法染色。所有操作步骤按试剂盒说明书进行。p53阳性着色定位于细胞核，呈黄色或棕褐色颗粒。每张切片随机选取10个高倍(400×)视野，每视野计数100个细胞，根据细胞染色强度和阳性细胞比例综合判断结果。细胞染色强度评分：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞比例评分：≤5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。两项得分乘积≥4为阳性表达。

2 结果

2.1 胃腺癌组织及癌旁正常组织TUG1表达比较 胃腺癌组织TUG1相对表达量为2.36±1.01、高表达90例(83.3%)，高于癌旁正常组织的0.93±0.54、18例(16.7%)，二者比较P均<0.01。

2.2 胃腺癌组织TUG1表达与患者临床病理特征的关系 TUG1相对表达量在胃腺癌低分化者高于高分化者，浸润深度T3、T4者高于T1、T2者，有区域淋巴结转移者高于无区域淋巴结转移者，有远处转移者高于无远处转移者，临床分期高者高于临床分期低者(P均<0.05)，但不同年龄、性别、肿瘤直径及有无脉管侵犯、神经侵犯患者TUG1相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 胃腺癌组织TUG1表达与患者临床病理特征的关系

2.3 胃腺癌组织及癌旁正常组织p53表达比较 胃腺癌组织p53阳性表达率为61%(66/108)，癌旁正常组织为39%(42/108)，二者比较P<0.01。

2.4 胃腺癌组织TUG1表达与p53表达的关系 Pearson相关分析显示，TUG1高表达与p53阳性表达呈正相关关系(r=0.204，P<0.05)。见表2。

表2 胃腺癌组织TUG1表达和p53表达的关系

3 讨论

胃癌的发生一般经历慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、上皮内瘤变等多个阶段，最终发展为进展期胃癌。在整个过程中，环境、饮食等因素发挥重要作用，同时伴随着多种癌基因激活、抑癌基因失活或缺失等改变。

lncRNA没有完整的开放阅读框架,不编码蛋白质,以RNA的形式发挥作用。越来越多研究表明，lncRNA在细胞代谢过程中具有重要作用，包括细胞增殖、分化、凋亡、侵袭等[4，5]。

TUG1在人类各种组织细胞中广泛表达，是调控视网膜及神经系统正常发育的必需基因，在小鼠大脑皮层发育的多个关键时期均能检测到高表达[6]。研究表明，TUG1在非小细胞肺癌、结直肠癌、肝细胞癌、胆管癌、B细胞淋巴瘤等组织中异常表达[7～9]。Baratieh等[10]研究发现，TUG1在胃癌组织中表达显著上调，且与患者临床病理特征密切相关。Zhang等[11]研究表明，TUG1在胃癌组织中表达升高，其表达变化能够促进胃癌细胞增殖。Isin等[12]研究表明，多发性骨髓瘤患者血浆TUG1水平明显高于体检健康者。Ren等[13]研究表明，在胃癌细胞BGC-823和SGC-7901中，TUG1可通过负性调节miRNA-145-5p，促进胃癌细胞的增殖、侵袭能力。但也有研究发现，TUG1在多种恶性肿瘤组织中低表达。Zhang等[14]研究表明，在非小细胞肺癌组织中TUG1表达明显低于癌旁正常组织，TUG1低表达与肿瘤患者预后差、肿瘤大小及TNM分期密切相关，且TUG1可作为非小细胞肺癌患者预后的独立预测因子。Fan等[15]研究表明，TUG1在乳腺癌组织中低表达，且与突变型p53表达及淋巴结转移密切相关。TUG1在不同肿瘤中的表达不一致，我们认为可能与各肿瘤的病因和发病机制不同有关。本研究选取108例份胃腺癌组织及癌旁正常组织，经real-time PCR检测发现，TUG1在胃腺癌组织中的高表达率及相对表达量均高于癌旁正常组织；进一步分析发现，TUG1高表达与患者肿瘤大小、浸润深度、区域淋巴结转移及临床分期有关。

TUG1启动子包含p53结合位点，可以由p53直接诱导表达，故p53对于TUG1表达具有重要的调控作用。p53是一种抑癌基因，按基因型不同，可分为野生型和突变型，其突变型由于空间结构发生变化，失去了抑癌基因作用，从而能促进肿瘤生长[16]。但在胃腺癌组织中鲜见TUG1表达与p53表达关系的报道。本研究结果显示，在胃腺癌组织中p53阳性表达率为61%，且与TUG1高表达呈正相关关系。由于本研究所选病例数相对较少，其结论是否准确还需要大样本量进一步验证。有研究结果表明，TUG1可上调HOBX7表达，而HOBX7启动子能与PRC2的关键分子EZH2结合。有研究认为，TUG1介导的对肿瘤细胞生长调控作用部分归因于对HOXB7的调节，从而参与AKT和MAPK信号通路[14]。本研究虽然发现TUG1高表达与p53阳性表达具有相关性，但其具体作用机制尚不清楚，有待于我们进一步研究。

综上所述，TUG1在胃腺癌组织中高表达，其在胃腺癌发生、发展过程中可能具有癌基因作用，且与肿瘤组织分化程度、浸润深度及临床分期密切相关。此外，TUG1高表达与p53阳性表达呈正相关关系。因此，检测TUG1和p53表达，将有助于评估胃腺癌临床分期及患者预后。