快速老化痴呆小鼠海马组织差异表达基因模式分析及治疗药物预测

刘涛,张雪竹,贾玉洁,韩景献,聂坤

(天津中医药大学第一附属医院,天津300193)

阿尔茨海默病是一种常见的神经退行性疾病，主要临床表现为进行性记忆障碍、失语、认知能力下降，其发病机制目前尚不明确[1]。老化是阿尔茨海默病的危险因素，但并不是所有人在老化过程中均出现阿尔茨海默病。因此，揭示阿尔茨海默病独有的老化模式，有助于阐明老化在阿尔茨海默病发生、发展过程中的作用机制。基于大数据的系统生物学分析方法为定性分析阿尔茨海默病的老化模式提供了可能性。美国国立卫生研究院NIH资助建立的网络集成式细胞内特征的公共数据(LINCS)项目(http://www.lincsproject.org/)，开发了Connectivity Map(Cmap)数据库，收集使用化合物处理和相关基因干扰剂处理的人类细胞基因表达信息。Cmap数据库包含大量细胞水平反应模式数据，同时开发了多种系统生物学分析工具，可从样品的基因组学数据进行模式化定性分析，揭示某种干预手段或药物处理对细胞基因表达模式的影响及可能机制[3]。SAMP8小鼠是一种典型的快速老化痴呆小鼠，在成年期即可出现典型伴随痴呆的快速老化特征，是常用的阿尔茨海默病动物模型[4]。2016年1月～2017年12月，我们分析了SAMP8小鼠及SAMR1小鼠海马组织差异表达基因，利用LINCS数据库模式化分析快速老化痴呆小鼠海马组织差异表达基因特征，并预测老年痴呆的治疗药物。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 2月龄(幼年)、8月龄(老年)SAMP8小鼠各20只(雌雄各半)，2月龄(幼年)、8月龄(老年)SAMR1小鼠各20只(雌雄各半)，均由天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供[动物许可证号SXCK(津)2015-0003]，饲养条件完全相同，自由摄食饮水。芯片杂交使用美国Affymetrix公司的Affymetrix GeneChip 645 System；芯片信号扫描使用Affymetrix公司的GeneChip 7G microarray scanner；TRIzol购自美国Invitrogen公司；小鼠基因芯片Affymetrix GeneChip Mouse Transcriptome Array1.0购自美国Affymetrix公司。

1.2 SAMP8、SAMR1小鼠海马组织差异表达基因抽提 颈椎脱臼法处死2月龄、8月龄SAMP8和SAMR1小鼠，取海马组织，置于预冷的玻璃匀浆器中匀浆，TRIzol法提取细胞总RNA，经紫外分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格。每月龄小鼠分别保留3份RNA样品制作基因芯片(版本号： Affymetrix GeneChip Mouse Transcriptome Array 1.0)。探针合成、芯片杂交与洗染、芯片扫描、数据初步分析均由北京博朗生科技有限公司完成。采用LINCS(http://lincs-dcic.org/)项目下GEO2Enrichr在线分析工具抽提和分析差异表达基因。统计学分析方法选择Characteristic Direction，以3个幼年SAMP8小鼠海马组织芯片作为对照，从3个老年SAMP8小鼠芯片数据中抽提具有统计学意义的差异表达基因(校正P<0.05)。同样方法抽提SAMR1老年小鼠具有统计学意义的差异表达基因。

1.3 快速老化相关基因GO富集、KEGG代谢途径分析 将上述差异表达基因导入富集分析工具Enrichr进行生物信息学分析。对差异表达快速老化基因进行GO富集分析，揭示其主要细胞定位、分子功能，P<0.05为差异有统计学意义。采用KEGG代谢途径分析差异表达快速老化基因的功能及代谢通路。

1.4 差异表达快速老化相关基因模式定性分析及治疗药物预测 使用LINCS项目下CREEDS网络在线分析工具对差异表达快速老化基因模式进行定性分析，查询与未知样本基因表达特征模式有相似或相反特征的LINCS数据库中已知表达模式[5]，采用小分子药物模块定性分析预测老年性痴呆的治疗药物。

2 结果

2.1 SAMP8、SAMR1小鼠海马组织差异表达基因筛选结果 伴随快速老化过程，SAMP8小鼠海马组织表达上调基因808个、表达下调基因186个；伴随正常老化过程，SAMR1小鼠海马组织表达上调基因306个、表达下调基因599个。进一步分析发现，SAMP8小鼠海马组织基因表达模式以上调为主要特征，SAMR1小鼠海马组织基因表达模式以下调为主要特征，二者共有61个表达上调基因和68个表达下调基因。SAMP8小鼠海马组织快速老化基因表达模式中，去掉共有基因，还有747个表达上调基因和245个表达下调基因具有特异性。

2.2 快速老化基因GO功能富集分析结果 表达上调基因中多个富集词条具有统计学意义，747个表达上调基因转录为蛋白质后主要定位于细胞质核糖体和线粒体，见表1；主要生物学过程是细胞中蛋白质合成分选、定位以及病毒核酸合成，见表2；主要分子功能是NADH 还原酶活性(NADH dehydrogenase activity,GO:0008137,校正P=3.138E-6)；245个表达下调基因分析结果差异均无统计学意义。SAMR1基因表达模式中，去掉共有基因，共有118个表达上调基因和531个表达下调基因具有特异性，GO功能富集分析结果未发现表达上调、下调基因差异有统计学意义。

表1 SAMP8小鼠海马组织表达上调基因细胞内定位的GO功能富集分析结果

表2 SAMP8小鼠海马组织表达上调基因生物学过程的GO功能富集分析结果

2.3 快速老化相关基因KEGG代谢途径分析结果 见表3。SAMP8小鼠海马组织基因表达模式中，747个表达上调基因有统计学意义的KEGG代谢网络途径，主要为线粒体氧化磷酸化途径、3种神经退行性疾病代谢途径(阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病)、核糖体蛋白质合成途径及非酒精性脂肪肝、大肠杆菌感染代谢网络途径；245个表达下调基因分析结果差异均无统计学意义。SAMR1小鼠海马组织基因表达模式中，118个表达上调基因和531个表达下调基因的KEGG代谢网络途径差异均无统计学意义。

表3 SAMP8小鼠海马组织表达上调基因的KEGG代谢网络途径分析结果

2.4 快速老化相关差异表达基因模式定性分析结果 单基因模块定性分析结果显示，与SAMP8小鼠基因表达模式匹配度排名靠前的单基因模块是Psap(GEO ID：GSE8307)；与SAMR1小鼠基因表达模式相似度最高的单基因模块是Pink1(GEO ID：GSE60413)。结果表明，SAMP8小鼠海马组织对快速老化产生的反应模式与Psap 基因过表达的反应模式匹配度最高，而SAMR1小鼠则与Pink1基因过表达的反应模式匹配度最高。

2.5 快速老化相关差异表达基因治疗药物预测结果 小分子药物模块定性分析结果显示，与SAMP8小鼠基因表达模式匹配度最高的小分子药物模块是烟酰胺核糖(维生素PP，GEO ID：GSE62194)；与SAMR1小鼠基因表达模式匹配度最高的小分子药物模块是Deltamethrin(GEO ID：GSE7955)。结果表明，维生素PP能模拟SAMP8小鼠海马组织细胞的基因表达模式，理论上可用于快速老化相关痴呆的治疗药物。

3 讨论

老化过程中细胞各项生理活动都处于逐渐衰退状态，各种功能基因的表达逐渐降低[6]。在SAMR1小鼠海马组织中快速老化基因转录水平降低，表达下调的基因数目远远多于表达上调基因。但SAMP8小鼠的快速老化模式与SAMR1小鼠正常老化模式明显不同，SAMP8小鼠海马组织中快速老化基因表达上调，且表达上调的基因数目远多于下调基因。上述结果表明，痴呆相关快速老化过程存在异常活跃的基因转录。

SAMR1小鼠海马组织中上调与下调基因散在、无序，因而在GO生物信息学分析和KEGG代谢网络途径分析中，无论是表达上调基因还是表达下调基因，均未出现有统计学意义的结果；SAMP8小鼠海马组织表达上调基因的GO分析和KEGG代谢途径分析结果均表现出明显集中性和富集特征，表达上调基因的细胞定位主要是核糖体和线粒体，表明大量的线粒体相关蛋白质在核糖体翻译合成；主要生物学功能是细胞中蛋白质合成分选、定位，表明很多基因参与新合成的线粒体蛋白质从核糖体转运到线粒体过程；主要分子功能是NADH还原酶活性，表明有很多快速老化基因参与线粒体氧化磷酸化过程[7]。线粒体相关基因高表达是细胞修复受损线粒体应激反应的主要特征。GO生物信息学分析结果提示，SAMP8小鼠痴呆相关的基因表达模式是一种特殊的细胞线粒体修复模式。KEGG代谢网络途径分析结果也支持这个观点。SAMP8小鼠海马组织表达上调基因涉及的关键代谢网络途径中，排在首位的是线粒体氧化磷酸化代谢途径[8]，有统计学意义的代谢途径还包括核糖体蛋白质合成途径以及3种神经退行性疾病代谢途径，表明SAMP8小鼠痴呆相关的基因表达模式具有典型的神经退行性疾病模式特征。

CREEDS分析工具的模拟效应模式定性分析结果显示，SAMR1小鼠海马组织快速老化基因表达模式类似于Pink1基因过表达模式。Pink1是一种蛋白激酶，能在身体任何细胞中表达，在大脑等耗能高的器官中表达尤为突出。在神经元内，主要位于线粒体内膜，Pink1可触发线粒体自噬过程，是线粒体功能衰退的标志[9]。这表明正常老化模式是一种以线粒体功能衰退为特征的模式。SAMP8小鼠海马组织快速老化模式则类似Psap基因过表达模式。Psap基因过表达模式是一种典型的神经元保护模式。Psap是一种鞘脂激活蛋白原(Prosaposin)，也是一个高度保守的糖蛋白。在神经系统中，分泌型Prosaposin是一种神经营养因子和髓鞘营养因子, 其鞘脂激活蛋白C区的N末端14个氨基酸残基具有营养活化功能；脑损伤后,Prosaposin过表达具有神经保护和神经营养的双重特性[10]。结果提示，与正常老化的线粒体功能衰退模式不同，快速老化模式以神经元保护功能为主要特征。

小分子药物模块定性分析结果提示，线粒体在痴呆小鼠生物学机制具有关键作用。维生素PP是人体13种必需维生素之一。烟酸在人体内转化为烟酰胺，烟酰胺是辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的组成部分，参与体内脂质代谢，组织呼吸的氧化过程和糖类的无氧分解过程。研究发现，维生素PP可促进线粒体电子传递链蛋白表达，提高线粒体膜电位，提高氧化呼吸率和细胞内ATP水平，促进线粒体再生[11]。维生素PP能增强线粒体的功能，最终抑制细胞衰老[12]。脑组织维生素PP消耗约占全身的70%。烟酰胺核苷对快速老化痴呆小鼠潜在的治疗作用提示，线粒体在痴呆发生、发展中具有重要作用。

综上所述，SAMP8小鼠海马组织的基因表达模式以神经元保护为主要特征，是一种特殊的细胞线粒体修复模式，其线粒体相关基因表达显著上调；主要作用靶点是细胞线粒体的维生素PP可能是老年性痴呆的有效治疗药物。