钙蛋白酶基因与畜禽肉质相关性研究进展

， ， ，，，，*，

(1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉 744000；2. 平凉市农产品质量安全检测检验中心)

钙蛋白酶系统是广泛存在于脊椎动物细胞中的一类半胱氨酸巯基内肽酶，是一种主要依赖Ca2+激活的蛋白水解酶，主要由钙蛋白酶(Calpain)、钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)及钙蛋白酶激活蛋白组成。目前发现的钙蛋白酶系统的同工酶有至少16种。广泛存在的钙蛋白酶根据其表现出半最高活性所需的Ca2+浓度的不同，主要分为两种，其中一种是μ-calpain (calpain l)，激活其所需的Ca2+浓度为微摩尔级，另一种为m-Calpain(Calpain2)，激活其所需的Ca2+浓度为毫摩尔级。

1 钙蛋白酶系统概述

钙蛋白酶最早是1964年由Gurof等在大鼠脑组织中发现并分离鉴定出的。后来，又先后从心肌、肝脏等组织中提取获得钙蛋白酶。1976年Daytion等人对该酶进行了分离纯化。1981年被命名为EC3.4.22.17，即钙蛋白酶或钙激活蛋白酶。1984年Ohno等第一次克隆出了该酶的cDNA 。1991年，该酶被正式命名为钙蛋白酶(Calpains)。

1.1 钙蛋白酶的结构

根据钙蛋白酶各同工酶所具有的不同结构特点，将其分为典型钙蛋白酶和非典型钙蛋白酶两种。典型钙蛋白酶由80 kD大亚基和30 kD小亚基组成，大亚基分为四个结构域，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，小亚基由Ⅴ和Ⅵ两个结构域组成。结构域Ⅰ位于N端，可以和30 kD的小亚基形成二聚体，起到活性调节作用；结构域Ⅱ是钙蛋白酶的核心结构域，在该区域存在由 Cys-His-Asn 肽残基构成的催化区域，是钙蛋白酶表现其水解活性的关键位置；结构域Ⅲ是钙蛋白酶的活性调节区域；结构域Ⅳ包含了5个钙蛋白酶所特有的EF-hand结构。典型钙蛋白酶包括Calpain 1、2、3、8、9、11、12和13，其中Caipain 1、2和9能与30 kD的小亚基形成异源二聚体，而Calpain3、8、12尽管含有结构域Ⅳ，却不能与30 kDa小亚基相互作用。非典型钙蛋白酶包括Calpain5、6、7、8b、10a和15，这类钙蛋白酶没有结构域Ⅳ，且其它3个结构域存在缺失或者替换，不能与小亚基形成二聚体。

1.2 钙蛋白酶功能及其作用机理

研究表明钙蛋白酶在宰后肌肉嫩化过程中发挥重要作用，被认为是影响肌肉嫩度的基本酶类。但不是钙蛋白酶的所有成员都对肌肉的嫩化过程起作用，有研究显示，在肌肉嫩化的过程中，m-calpain的活性几乎保持不变，而μ-calpain的活性显著下〗。而钙蛋白酶活性下降是其发挥水解作用的体现，因此人们广泛认为是μ-calpain参与肌肉的嫩化，而m-calpain并不参与这一过程。

动物机体中的Ca2+在正常状态下主要存在于肌质网内，而细胞质内的 Ca2+的浓度约是10～7mol/L。屠宰后的肌肉在冷却时会受到刺激，肌质网则失去保护Ca2+的能力，从而Ca2+被释放到细胞质中，导致肌纤维细胞质内游离的 Ca2+浓度升高到大于10～6 mol/L。因而使Calpain被激活，并且开始降解肌纤维蛋白，使肌纤维的Z盘崩解，肌原纤维破碎，进而使肌肉嫩度增加。

1.3 钙蛋白酶活性调节

钙蛋白酶活性的调控机制十分复杂，主要包括Ca2+浓度的正调控和钙蛋白酶抑制蛋白的负调控。细胞内钙离子浓度升高后，Ca2+与钙蛋白酶的EF-hand结构结合，随后Calpain的大小亚基分离，发生自溶现象，构像发生变化，暴露出具有催化活性的半胱氨酸三联体结构，从而表现出钙蛋白酶的水解活性。但只有当钙离子浓度高于2μmol/L时钙蛋白酶才会被激活，细胞内的钙离子浓度一般为0.2～0.8μmol/L，所以一般情况下钙蛋白酶处于未激活状态。在动物屠宰后，肌浆网内的钙离子释放，钙离子浓度显著升高，激活了钙蛋白酶，促进动物屠宰后肌肉的成熟嫩化。

钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)则是专一性的钙蛋白酶活性的抑制蛋白。CAST与Calpain结合的过程是可逆的，这个过程同样也要依赖Ca2+的参与完成。正常情况下Calpain主要在细胞膜，细胞内钙离子浓度升高后，Ca2+则会和Calpain结合并使其表现对底物水解作用，这时CAST就会竞争性的结合Calpain，导致Calpain的活性降低，从而防止了Calpain对细胞的破坏；继续提高Ca2+浓度，此时Calpain才会表现其蛋白酶水解活性。除此之外，钙蛋白酶的活性还受离子强度、pH及底物蛋白磷酸化等因素影响。

2 钙蛋白酶基因

2.1 CAPN1基因

CAPN1是钙蛋白酶基因家族研究最多的成员之一，在肌原纤维蛋白降解中起着重要的作用，与肌肉增长和宰后嫩度的变化及蛋白质水解程度密切相关。目前已克隆了人、猴、大鼠、小鼠、鸡、猪、兔、牛和牦牛的CAPN1基因的cDNA序列，不同物种的基因序列的结构和长度差异较大。据GenBank上公布的序列，人的CAPN1基因位于11号染色体上，由22个外显子和21个内含子组成；鸡的CAPN1基因位于3号染色体上，由21个外显子和20个内含子组成；小鼠CAPN1基因全长21 kb，含有28个外显子；牛的CAPN1基因位于29号染色体，该基因的mRNA序列长为26517 bp，由22个外显子和21个内含子构成，内含子远远大于外显子。

2.2 CAPN2基因

由于大多数的研究认为CAPN2基因不参与肌肉嫩化的过程，因此对该基因的研究相对较少。人的CAPN2基因位于1号染色体上，mRNA长度为3 270 bp，由21个外显子和20个内含子组成；鸡的CAPN2基因位于3号染色体上，rnRNA序列长为2 723 bp(NM 2050801)，由21个外显子和20个内含子构成；牛的CAPN2基因位于16号染色体上，mRNA长度为3 207 bp；刘仲娜等通过电子克隆技术与序列分析，得到牦牛的CAPN2基因cDNA全长为3 200 bp，包含一个2 103 bp的开放阅读框，共编码700个氨基酸。牦牛 CAPN2 的核苷酸序列与普通牛、羊、马、猪、小鼠、鸡、人相应序列间的一致性分别为99%、97%、90%、87%、85%、79%、90%。

2.3 CAPN3基因

CAPN3也是钙蛋白酶家族中的一个成员，有 CAPN3a(p94)和CAPN3b(LP82)两个变异剪接体，CAPN3a 有24个外显子，4个结构域，全长约50kb，分子量为94 kD。CAPN3a通过可变剪切去掉外显子6、15和16，并且采用不同的核苷酸序列作为外显子1，就形成了CAPN3b。人类CAPN3蛋白氨基序列与CAPN1的同源性为51%，与CAPN2的同源性为54%。骨骼肌特异性蛋白酶只在骨骼肌细胞中表达，其表达量是普通钙蛋白酶的好几倍，呈现出高度的表达特异性。目前关于CAPN3 基因的研究，主要集中在CAPN3基因的克隆、多态性分析、基因表达差异以及与牛、羊、猪、及鸡、鸭等物种肉质及胴体重相关性的分析上，同时在其与人类疾病的相关性研究中也取得了一定的进展。人类CAPN3基因定位于15号染色体上，基因组大约138 kb。mRNA 长度为3 316 bp，由24个外显子组成。普通牛CAPN3 基因位于第10号染色体。Ilian等研究发现 CAPN3蛋白表达水平与肉的嫩度存在显著相关性，在绵羊上CAPN3蛋白水平和mRNA水平与嫩度具有高相关性。因此，CAPN3基因也可以作为嫩度性状的一个候选基因。

3 钙蛋白酶1(CAPN1)基因与肉质相关性的研究

目前，CAPN1基因作为肉质性状的候选基因报道较多，并逐渐应用于肉品嫩度性状的标记辅助选择。Susan Castro等研究了CAPN1基因与牛肉色的相关性，结果表明，CAPN1基因与肌肉的肉色值没有显著相关性，但作者认为该基因仍可以作为研究肉色性状的一个候选基因。也有大量研究报道CAPN1基因与畜禽宰后肌肉成熟嫩化相关。Casas等将影响牛肉嫩度的QTL定位于14和29号染色体，并在CAPN1基因中检测到316 bp、4 753 bp和5 331 bp的SNPs突变位点，随后又在瘤牛中发现同样的3个SNP突变位点，表明CAPN1基因316位点突变与嫩度存在显著相关。Iglesias等采用ARMS-PCR和PCR-RFLP方法对Hereford牛，Brahman牛和 Braford牛群体进行研究后在内含子17上发现了一个插入/删除突变，认为该突变是一个非常有价值的与肉质相关的候选基因，并可以帮助解决热带地区舍饲牛的肌肉嫩度问题。Hoyoung Chung等研究表明，CAPN1基因的三个遗传标记与牛肉剪切力显著相关，并对剪切力有显著的累加效应，因此可以作为研究肉质嫩度的一个候选基因。陆克龙采用PCR-SSCP的方法对灵山土鸡CAPN1基因外显子5进行多态性检测，发现2个突变位点，4种不同的基因型，不同基因型在剪切力、肌内脂肪含量上存在差异。束婧婷等在清远麻鸡和隐性白羽肉鸡CAPN1基因外显子5和外显子6中检测到3个突变位点，且隐性白羽肉鸡中不同基因型个体的剪切力和系水力之间存在显著差异，因此认为该基因的SNPs影响肌肉的剪切力和系水力等性状，说明该基因可能是影响鸡的肌肉嫩度的主效基因连锁。

也有研究表明CAPN1基因突变除影响屠宰后肌肉嫩度外，也与其他胴体及肉质性状相关，武秀香等采用PCR-SSCP检测到雷琼牛、BMY牛、中国西门塔尔牛和云南高峰牛CAPN1基因两个多态位点A4558G和C4684T，其中A4558G突变与胴体产肉率、骨重和肉骨比显著相关，C4685T突变对宰前活重、胴体重、净肉重、网膜油重及肠系膜油重性状效应显著；张彩霞等在早胜牛CAPN1基因第9外显子检测到G458C突变位点，形成GG、GC和CC 3种基因型，该位点与剪切力值、pH和滴水损失存在显著相关，CC基因型个体剪切力值和滴水损失显著低于GG和GC基因型个体。Xin L〗等在5个品种牛中检测到CAPN1基因的一个多态位点CAPN1:c947，包含CC、CG和GG三种基因型。该多态位点与宰后6 days的肉色hue值、肌内脂肪含量和大理石纹评分显著相关，且CG基因型个体的肉色hue值高于其余两种纯合子的，肌内脂肪含量和大理石纹评分为CC基因型个体的高于CG基因型和GG基因型个体的。

4 总结

钙蛋白酶是一种蛋白水解酶，不仅在调节宰后畜禽肉质嫩度方面发挥重要作用，而且通过对细胞骨架蛋白、磷酸酶和蛋白激酶的作用，参与肌肉生长、细胞凋亡、细胞增殖与分化、信号转导等过程。同时，钙蛋白酶系统因参与机体生长、代谢以及肌原纤维更新的过程而与一些疾病密切相关，但针对具体疾病的相关机制还有待于进一步研究。