通过理性改造提高11家族木聚糖酶热稳定性研究进展

吴占东， 韩文杰， 周 同， 张培玉*

(1.青岛大学 环境科学与工程学院，山东 青岛 266071；2.滨州职业学院 继续教育学院,山东 滨州 256603)

植物细胞中主要含有纤维素、半纤维素、木质素三种高分子化合物，其中半纤维素是除纤维素之外含量最高的多糖，半纤维素的主要骨架是由木聚糖构成的，利用木聚糖酶将木聚糖水解为可发酵的单糖或寡糖在造纸与饲料工业中有着很高的应用前景，也解决了当前浪费严重的农业废弃物问题[1-3]。木聚糖的构成较为复杂，通常侧链都含有不同程度的取代基，如阿拉伯糖、O-乙酰基、阿魏酸和 4-O-甲基葡萄糖醛酸等[4]，因此要完全降解需要一系列酶系协同作用。能够降解半纤维素的酶制剂，主要包括β-1,4-木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和阿魏酸酯酶等[5]。一般来说，β-1,4-木聚糖酶能够从内部断裂木聚糖主链的糖苷键，释放出低聚木糖，是半纤维素降解过程中最重要的酶之一。根据NCBI预测的不同结构域可将木聚糖酶归分为不同的糖苷水解酶家族，其中大部分木聚糖酶属于GH10和GH11家族，而11家族木聚糖酶由于体积较小，比酶活较高(一般大于1 000 U/mg)，有着广泛的pH稳定性和温度稳定性而逐渐获得了更多 关注，到目前为止，根据CAZy数据库结果显示(www.cazy.org)，已经有1 182种来自不同微生物产生的11家族木聚糖酶得到确认，但只有200多种得到表征，得到晶体结构的只有29种，GH11家族木聚糖酶晶体结构通常是由两个反向平行并高度螺旋的β折叠和α螺旋相互作用组成一个类似右手的结构(图1)，在底物结合裂缝区域(活性中心)有一对羧酸。

图1 典型11家族木聚糖酶晶体结构[6]Fig.1 The typical crystal structure of GH11 xylanase[6]

自然条件下大多数木聚糖酶因为没有较好的热稳定性和比酶活而不能适应工业化需要。因此，嗜热型木聚糖酶有着广阔的工业应用前景，目前，获得热稳定木聚糖酶的方法基本只有两种，一是从嗜热微生物克隆基因进行异源表达，二是利用分子生物学方法在蛋白质结构上进行理性改造从而提高木聚糖酶的热稳定性，研究者主要通过在酶表面增加二硫键，或者将酶蛋白进行翻译后糖基化修饰，或者增强蛋白内部疏水作用来增加蛋白质三级结构的稳定性以提高木聚糖酶的热稳定性。本文将主要从以上几个方面对GH11家族木聚糖酶热稳定性分子改造的技术和方法进行综述，为进一步提高GH11家族木聚糖酶的热稳定性提供参考。

1 GH11家族木聚糖酶改造的常用技术和方法

1.1 二硫键对木聚糖酶热稳定性的影响

二硫键是蛋白质分子中两个半胱氨酸之间的-SH基被氧化而形成的存在于硫原子间的键，作为一种分子内共价键对蛋白质结构的稳定有着非常重要的影响。GH11家族木聚糖酶的结构主要由一个α螺旋和两个反向平行的β折叠片层组成一个半握的右手状，将二硫键引入提高热稳定性一般集中在蛋白质表面进行，目的都是在不影响酶活性位点的情况下使蛋白质的结构更加稳定。

11家族木聚糖酶N末端对其蛋白分子的稳定性有重要影响，因此目前在酶蛋白表面添加体外二硫键主要集中于酶的N末端。韩承业等[7]在来源于里氏木霉Trichdermareesei的木聚糖酶的N末端两个β折叠片层间添加了一个二硫键(T2C-T28C)，发现突变酶最适温度由50 ℃提高到60 ℃，70 ℃下的半衰期由1 min提高到了14 min。闵柔等[8]以11 家族耐热木聚糖酶 EvXyn11TS为研究对象，通过多序列同源比对发现EvXyn11TSN端存在一个二硫键(Cys5-Cys32)，通过定点突变将此二硫键去掉后发现其最适温度由突变前的85 ℃降为70 ℃，在90 ℃的半衰期由32 min降为9 min，说明N端二硫键的存在对木聚糖酶EvXyn11TS的热稳定性有重要影响。高树娟等[9]以此为基础，将EvXyn11TS的含有一个二硫键的N末端替换到来自米曲霉Aspergillusoryzae的11 家族木聚糖酶AoXyn11A，使重组酶最适温度由改造前的50 ℃提高到75 ℃，在70 ℃的半衰期由1 min提高到197 min。Cheng等[10]在对来自胃瘤真菌Neocallimastixpatriciarum的11家族木聚糖酶XynCDBFV进行研究时发现，其拥有一个由11个氨基酸组成的很长的N末端，上面的很多氨基酸残基能与β片层上的一些残基形成相互作用力而增强其结构的稳定性，其中第四位的半胱氨酸与β片层的第172位半胱氨酸之间形成的二硫键至关重要，通过定点突变将二硫键去掉后发现其在高温下的酶活与热稳定性都有了非常明显的降低。为进一步研究XynCDBFV的很长的N末端对其热稳定性的影响，本实验室通过分子生物学方法将XynCDBFV木聚糖酶的很长的N末端克隆到来自嗜热厌氧菌Caldicellulosiruptorsp. F32的11家族木聚糖酶XynA上并且在其能够形成二硫键的位点做了相应的点突变以期提高酶的热稳定性，但是结果发现重组酶的比酶活由改造前的2 567 U/mg下降到1 106 U/mg，在85 ℃的半衰期由改造前的8 h下降到0.5 h。随后，在重组酶上进一步进行定点突变在N末端加入一个二硫键(Cys5-Cys31)，结果使其酶活不变的情况下最适温度由改造前的80 ℃上升为85 ℃，在85 ℃的半衰期由0.5 h提高到10 h。综合作者实验结果说明在酶蛋白分子中正确的位点添加二硫键确实会增强其热稳定性，但来源不同的木聚糖酶虽同属11家族，蛋白质结构却存在一定差异，在XynCDBFV中形成的二硫键在XynA中反而使其酶活位点更暴露，从而降低了其热稳定性，这也说明在不正确的地方添加二硫键可能不仅不会增强其热稳定性，反而会达到相反的效果。

利用同源序列对比，借鉴其他木聚糖酶二硫键的位置相应的引入二硫键也是增强木聚糖酶热稳定性的方法。刘晓彤等[11]将源于Thermomyceslanuginosus的耐热木聚糖酶 XynA 中存在的一个二硫键引入米曲霉木聚糖酶AoXyn11A(Cys108-Cys152)，使突变酶的最适温度由55 ℃提高到60 ℃，在50 ℃的半衰期较改造前提高了近两倍。Jeong等[12]对来自BacillusstearothermophilusNo. 236的11家族木聚糖酶进行研究，利用 disulfide by design(http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2/index.php)程序预测出能够对接成功形成二硫键的氨基酸对，然后与同样来自11家族的其他30多个木聚糖酶进行序列对比，将这些预测点在其他11家族木聚糖酶中对应的是半胱氨酸的作为突变点，最终选择了第100位和第150位之间加入二硫键，使其在60 ℃下半衰期由147 min上升为386 min。

二硫键的添加并不会改变木聚糖酶特有的三维结构，它只是通过减少蛋白去折叠状态的熵变从而对蛋白的构象起稳定作用。因此，作为稳定蛋白三级结构的一种方法，通过引入体外二硫键提高11家族木聚糖酶的热稳定性使其更适应工业用酶的需要正在被越来越多的研究人员所重视。

1.2 糖基化对木聚糖酶热稳定性的影响

糖基化是指蛋白在真核生物细胞内得到翻译后经内质网和高尔基体与糖结合形成糖蛋白的过程，主要包括糖基与天冬酰胺侧链基团或者丝氨酸与苏氨酸的羟基之间形成的共价键。作为一种蛋白的 翻译后修饰方法，糖基化木聚糖酶由于疏水性增强，导致蛋白的可溶性增强，也降低了非特异性蛋白之间的相互作用力。木聚糖酶发生糖基化后，酶表面的糖链可能会对整个结构起到包裹作用，从而增强木聚糖酶的热稳定性。同时，这些糖链还可能覆盖某些蛋白质表面的蛋白酶酶切位点，增强蛋白对蛋白酶的抗性[13]。

Fonseca-Maldonado等[14]系统地研究了糖基化对蛋白热稳定性的影响，实验将来自Bacillussubtilis的11家族木聚糖酶XynA转入毕赤酵母获得糖基化使蛋白在55 ℃下的半衰期由8 min上升到20 min，随后又通过一系列实验说明：糖基化在Asn-Xaa-Thr的顺序比在Asn-Xaa-Ser的顺序更容易发生；蛋白并不是糖基化位点越多对热稳定性提升越明显，而是发生糖基化的位置更加重要；糖基化会增强糖链与蛋白之间以及糖链之间的相互作用力，但是只有增强糖链与蛋白之间的作用力才有可能提升热稳定性。Zhao等[15]将来自Thermobifidafusca的11家族木聚糖酶Xyn11A转入毕赤酵母X33中进行糖基化表达，使该酶最适温度由60 ℃升至80 ℃，最适pH由7.0升至8.0，热稳定性也有了明显提高。受此启示，本实验室将来自Caldicellulosiruptorsp. F32的11家族木聚糖酶XynA截短催化模块TM1在毕赤酵母GS115中表达过后发现该酶在酶活没有明显差异的情况下热稳定性在80、85 ℃下较在大肠埃希菌中表达分别提高了1.5倍、2倍，后经过验证，该酶存在的两个远离催化中心的糖基化位点(天冬酰胺N23、N189)对热稳定性有明显的提高作用[16]。

1.3 疏水作用对木聚糖酶热稳定性的影响

疏水性氨基酸一般指来自非极性的脂肪族和芳香族氨基酸，常存在于蛋白质内部疏水区域，最大程度避免与水结合且保守性要高于其他区域，它们对于稳定蛋白质的三级结构起着重要作用。另外，疏水性氨基酸在发生酶促反应过程中酶与底物之间通过各种作用力形成各种非共价键的分子结合方面也具有重要作用[17]。

目前，几乎所有嗜热酶和嗜温酶的内部疏水中心都非常保守，序列对比比较一致，因此，通过引入疏水性氨基酸增强蛋白的疏水作用往往发生在酶表面。李同彪等[18]和柏文琴等[19]分别对来自AspergillusnigerXZ-3S的11家族木聚糖酶XynZF-2和来自芽胞杆菌Bacillussp. SN5的11家族木聚糖酶Xyn11A-LC引入芳香族氨基酸，同时将第9位氨基酸改为酪氨酸，第14位改为苯丙氨酸，二者通过苯环形成堆积作用(stacking force)，增强了木聚糖酶分子的刚性，从而使酶的最适温度和热稳定性得到提升。此后，李同彪等[20]又将XynZF-2的α螺旋处引入疏水性氨基酸，将Val125、Lys178和Gly180分别突变为疏水性氨基酸Ala、Met 和Ala，使得突变酶最适温度由40 ℃提高到48 ℃，在45 ℃的半衰期由改造前的7 min提高到了19 min。杨浩萌等[21]在来源于Streptomycesolivaceoviridis的木聚糖酶XynB的折叠簇β1与β2之间引入一个酪氨酸，研究折叠簇之间的疏水作用对木聚糖酶热稳定性的影响，发现突变酶在毕赤酵母中表达后较野生型不仅热稳定性显著提高，比酶活也上升了33%，Km值比原酶降低43%，说明突变酶较原酶有着更好的催化效率。

增强蛋白内部疏水中心的疏水结合也可以增强蛋白分子的稳定性，Yo等[22]通过定向进化和定点突变获得并鉴定了来源于胃瘤真菌Neocallimastixpatriciarum的木聚糖酶XynCDBFV内部疏水核心的一个点突变(G201C),该点突变导致突变体的比酶活和热稳定性都得到明显提高。SDS-PAGE和DTNB法测定自由 巯基的数量均表明这两个位点的半胱氨酸之间并没有形成二硫键。经过验证，在该突变体中，201位和50位的半胱氨酸所形成的疏水结合是导致热稳定性提高的主要原因。

1.4 其他作用对木聚糖酶热稳定性的影响

研究发现，11家族木聚糖酶的热稳定性也受蛋白表面精氨酸含量，以及盐桥、离子对、氢键等因素影响。精氨酸由于解离常数较大且对酶促反应的敏感度较低，因此比其他氨基酸更能适应高温环境[23]， 此外，精氨酸由于侧链胍基容易与其他氨基酸残基形成氢键等相互作用从而稳定蛋白构象。11家族木聚糖酶三维结构中存在着一个保守的Ser/Thr平面，该平面富含丝氨酸和苏氨酸，Turunen等[24]首先尝试在Trichodermareesei的11家族木聚糖酶分子Ser/Thr平面的苏氨酸和丝氨酸突变为精氨酸后，使得酶的热稳定性得到提升，周晨妍[25]和李飞等[26]受此启发，利用同样的原理将精氨酸引入11家族木聚糖酶Ser/Thr表面，使突变酶热稳定性得到提高。有人发现增加脯氨酸的数量或减少甘氨酸的数量也会增强蛋白的热稳定性，这可能是因为降低了蛋白质去折叠态的熵变来增加结构稳定性。Wang等[27]通过将来自Streptomycessp. strain S9的木聚糖酶XynAS9进行点突变(V81P, G82E)从而提高了热稳定 性，可能是因为81与82位氨基酸所在的β折叠片层末端折叠的并不是很紧凑，将这两个点突变后增强了这部分的刚性，并且将活性位点附近的与底物接触有关的长裂隙底部填充，从而增强了木聚糖酶的热稳定性。此外，氨基酸侧链之间由于所带正负电荷不同而形成的离子键也会对木聚糖酶热稳定性起到一定作用[28-29]。

2 结 论

木聚糖酶作为半纤维素降解过程中的最为关键的酶而被广泛应用于食品、造纸、能源、饲料等行业，而11家族木聚糖酶由于分子体积小、比酶活较高等诸多优点而更适于工业过程的需要[30]，但是，工业用酶特别是造纸需要木聚糖酶在高温条件下保持高酶活和热稳定性，自然条件下的大多木聚糖酶很难达到在高酶状态下同时具有很好的热稳定性[31]。因此，通过一定的分子生物学方法对木聚糖酶进行三级结构的改造，使其构象更加稳定，从而能够适应工业过程的高温条件已经成为可能。目前，研究者主要通过定点突变的方法改变酶蛋白分子的某些氨基酸残基，使其之间能够形成各种分子内作用力以增强分子结构的稳定性。李同彪等[32]详细介绍了目前利用较多的通过分子改造手段增加二硫键对提高木聚糖酶的热稳定的影响，而本文针对目前11家族木聚糖酶改造时常用的几种方法(二硫键、糖基化、疏水作用和其他方法)，论述了它们在提高木聚糖酶热稳定性方面的原理和意义，旨在帮助研究者们进一步加深对11家族木聚糖酶作用机制的了解，同时为指导11家族木聚糖酶的分子改良提供借鉴。

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