临床产ESBLs大肠埃希菌整合子检测及基因型分析

蓝惠华， 张 玲， 王玮玮， 杨 艳， 程 玲， 骆园园， 金丹丹， 王厚照

(厦门大学附属成功医院 检验科,福建 厦门 361003)

质粒编码的超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum Beta-Lactamases，ESBLs)是革兰阴性杆菌中抵抗β-内酰胺酶类抗生素的最主要机制之一，自20世纪80年代初首次报道以来，β-内酰胺酶类抗生素尤其是广谱头孢菌素的滥用，是导致产ESBLs菌株广泛流行的主要因素[1]。产ESBL大肠埃希菌(ESBL-EC)是目前临床分离的最常见的产ESBLs菌株，可引起医院许多严重和致命性感染，如脑膜炎和血液感染等。整合子与细菌多重耐药和耐药基因播散密切相关，为了解ESBL-EC的β-内酰胺类获得性耐药基因与整合子遗传标记存在状况，对98株ESBL-EC进行了14种β-内酰胺类获得性耐药基因以及3种整合子标记(Intl1、Intl2和Intl3)检测，为临床治疗、预防产ESBLs 细菌引起的感染提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 分离的ESBL-EC菌株来源于2014年1月至12月厦门大学附属成功医院住院患者的中段尿、阴道分泌物、血液等标本，剔除同病例相同部位重复分离的菌株，共98株。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌 ATCC27853，由该院微生物室保存提供。

1.1.2 仪器和试剂 生物安全柜(HFSAFE-1200B2)，哥伦比亚血琼脂平板(郑州安图)，CO2恒温培养箱(MCO-15AC)，VITEK-Compact 2全自动微生物分析系统(法国梅里埃公司)，Micro17R微量冷冻离心机，Thermo微量移液器，恒温金属浴，XW-80A型旋涡混合器，Nanophotometer超微量可见分光光度计，BIO-Rad S1000基因扩增仪，BIO-Rad电泳仪，BIO-Rad凝胶成像系统。dNTPs、TaqDNA聚合酶、蛋白酶K和DNA Marker由TaKaRa公司提供；TBE电泳缓冲液由实验室自配；MH琼脂和药敏纸片购自英国OXOID公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离和鉴定及药物敏感试验 采用VITEK-Compact 2全自动微生物分析系统配套的鉴定卡和药敏卡进行细菌鉴定及药敏。超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌的检测则采用美国临床实验室标准化委员会(NCCLs)推荐的双纸片法。结果按照美国临床实验室标准化研究所(CLSI 2013 年版)的标准进行判读[2]。

1.2.2 引物设计 耐药基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，见表1。

1.2.3 DNA模板制备[6]将菌株接种血平板，37 ℃培养18～24 h，取少许纯培养菌落于装有200 μL无菌蒸馏水的1.5 mL EP管中，充分震荡混匀。恒温金属浴100 ℃煮沸10 min，煮沸时防止管盖爆开，取出冷却，14 000 r/min离心10 min，取上清，采用超微量可见分光光度计检测提取的DNA含量，用无菌蒸馏水调整为实验所需浓度(200～300 ng/μL)。

1.2.4 基因检测 采用 PCR法检测，引物及目的片段大小见表1，反应体系总体积为50 μL，其中10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，1 mmol/L dNTPs 4 μL，上下游引物各 1 μL，DNA模板 2 μL，Taq酶0.3 μL，无菌水补充至50 μL。整合子基因反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 8 min。超广谱β-内酰胺酶基因反应条件：93 ℃ 2 min；93 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物在2%琼脂糖凝胶中(含0.5 g/mL溴化乙锭)，120 V 电压，电泳40 min，凝胶成像仪观察结果，并拍照保存。

表1 基因引物序列、产物终长度及退火温度

1.2.5 统计学处理 利用SPSS17.0软件进行分析，耐药率的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 ESBL-EC菌株药敏试验结果

98株ESBL-EC对抗菌药物耐药情况严重，对氨苄西林、哌拉西林、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、复方新诺明、环丙沙星、左氧氟沙星、四环素、庆大霉素耐药率较高，耐药率均大于50%，对妥布霉素耐药率为31.62%，呋喃妥因、阿莫西林/克拉维酸和阿米卡星较敏感，分别为11.11%、13.4%和6.12%；对替加环素、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南和厄他培南最敏感，未见耐药菌株(表2)。

2.2 PCR扩增结果

2.2.1 整合子基因型 98株ESBL-EC中，47.96%(47/98)的分离菌株为Ⅰ类整合子阳性，3.06%(3/98) 的分离菌株为Ⅱ类整合子阳性，所有菌株中有1株同时含Ⅰ类和Ⅱ类整合子，未检出Ⅲ类整合子。电泳图见图1～2。整合子阳性与阴性菌株的耐药率，除四环素与复方新诺明具有统计学差异(P<0.05)，其余抗生素差异均无统计学意义(表2)。

图1 Ⅰ类整合子遗传标记电泳图Fig.1 Electrophorogram of Intl1 amplified productsM1：DNA markerⅠ；P：阳性对照；N：阴性对照；9～12、14：阳性菌株；13：阴性菌株M1:DNA markerⅠ；P: Positive control; N: Negative control; 9-12, 14: Positive samples; 13: Negative sample

图2 Ⅱ类整合子遗传标记电泳图Fig.2 Electrophorogram of Intl2 amplified productsM2：DNA markerⅡ；P：阳性对照；N：阴性对照；1～6：阴性菌株；7：阳性菌株M2: DNA markerⅡ; P: Positive control; N: Negative control; 1-6: Negative samples; 7: Positive sample

抗生素总耐药率/%整合子阳性菌株(n=49)敏感(S) 中介(I) 耐药(R)整合子阴性菌株(n=49)敏感(S) 中介(I) 耐药(R)χ2P氨苄西林100.000.000.00100.000.000.00100.00--阿莫西林/克拉维酸13.4058.3333.338.3351.0230.6118.372.2170.136哌拉西林100.000.000.00100.000.000.00100.00--哌拉西林/他唑巴坦0.00100.000.000.00100.000.000.00--头孢唑啉100.000.000.00100.000.000.00100.00--头孢噻肟100.000.000.00100.000.000.00100.00--头孢曲松100.000.000.00100.002.040.0097.961.0000.500头孢他啶81.4013.040.0086.9625.000.0075.002.4500.118头孢吡肟51.0246.942.0451.0244.904.0851.050.0001.000氨曲南72.4524.490.0075.5130.610.0069.390.4600.498复方新诺明67.3514.290.0085.7151.020.0048.9815.034<0.001环丙沙星70.4130.614.0865.3124.490.0075.510.6540.419左氧氟沙星63.2732.6510.2057.1426.534.0869.391.5810.209妥布霉素31.6215.0014.0020.0025.0013.0011.003.8220.051替加环素0.00100.000.000.00100.000.000.00--四环素76.748.700.0091.3040.000.0060.0014.126<0.001呋喃妥因11.1168.9713.7917.2470.5923.535.892.5600.110亚胺培南0.00100.000.000.00100.000.000.00--厄他培南0.00100.000.000.00100.000.000.00--庆大霉素60.2030.610.0063.3948.980.0051.021.5000.221阿米卡星6.1289.800.0010.2097.960.002.04-0.204

注：“-”表示无相关的统计量

2.2.2 超广谱β-内酰胺酶基因型 98株ESBL-EC中，TEM基因阳性61株(62.24%)，CTX-M-9基因阳性52株(53.06%)，CTX-M-1基因阳性32株(32.65%)，CTX-M-2基因阳性4株(4.08%)，SHV基因阳性3株(3.06%)，7株未检出基因型(7.14%)。基因分布以TEM+CTX-M-9基因阳性组(共30株)最多见，占30.61%，单CTX-M-9基因阳性组(共16株)和TEM+CTX-M1基因阳性组(共15株)较多见，分别占16.33%和15.31%，单TEM基因阳性组和单CTX-M1基因阳性组分别占10.2%和12.24%。TEM和CTX-M-9基因电泳图见图3、图4。各基因型检出情况及分布见表3。

图3 CTX-M-9基因PCR电泳图Fig.3 Electrophorogram of CTX-M-9 gene amplified productsM2：DNA markerⅡ；P：阳性对照；N：阴性对照；68、69、71、73：阳性菌株；70、72：阴性菌株M2: DNA markerⅡ; P: Positive control; N: Negative control; 68, 69, 71, 73: Positive samples;70,72: Negative samples

图4 TEM基因PCR电泳图Fig.4 Electrophorogram of TEM gene amplified productsM1：DNA markerⅠ；P：阳性对照；N：阴性对照；1、2、5～7：阳性菌株；3、4、8：阴性菌株M1:DNA markerⅠ; P: Positive control; N: Negative control; 1, 2, 5-7: Positive samples; 3,4,8: Negative samples

基因型菌株数构成比/%TEM1010.20CTX-M-11212.24CTX-M-91616.33SHV11.02TEM+CTX-M-11515.31TEM+CTX-M-93030.61CTX-M-1+CTX-M-211.02CTX-M-2+CTX-M-911.02TEM+CTX-M-9+CTX-M-122.04TEM+CTX-M-1+CTX-M-211.02TEM+CTX-M-9+SHV22.04未分类型别77.14合计9899.99

3 讨 论

大肠埃希菌是临床常见的条件致病菌，也是医院感染的常见致病菌。近年来，由于临床上广泛使用β-内酰胺类抗生素(尤其是头孢菌素类抗生素)治疗大肠埃希菌感染性疾病，导致产超广谱β-内酰胺的大肠埃希菌(ESBLs-producingEscherichiacoli，ESBL-EC)的分离率越来越多，并引起国内外研究者的广泛关注。例如欧洲ESBL-EC分离率由冰岛的5%到保加利亚的近40%，平均占12.6%[7]；而在中国、印度或中东的ESBL-EC检出率更高，如2012年报道的印度检出率高达76.8%[8]；CHINET监测数据显示，2014年度我国ESBL-EC检出率为55.8%[9]，因而持续的监控系统和有效的感染控制措施是必要的。

ESBLs由质粒介导，可通过接合、转化或转导等形式使耐药基因在同种属甚至不同种属细菌间传递扩散，给临床治疗带来众多问题。本研究药敏结果显示：ESBL-EC菌株对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类(除阿米卡星外)、喹诺酮类等抗菌药物耐药率均较高，这可能是由于ESBLs是β-内酰胺酶基因发生突变导致氨基酸的改变，由质粒携带，可使氨基糖苷类、喹诺酮类等抗菌药物的耐药基因在细菌之间传递扩散相关[10]。对阿米卡星耐药率比较低，但是阿米卡星具有肾毒性、耳毒性，临床上应慎重使用。对替加环素、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南和厄他培南极敏感，因此建议在临床治疗中可根据患者的病情、实际情况选择这些抗菌药物。

随着新型β-内酰胺酶的不断产生，ESBLs基因型也越来越多，各种ESBLs基因型间的遗传背景及功能特征有一定的差异，因此，对ESBLs基因型再细分研究是必要的。ESBLs在世界各国广泛流行，但不同国家、不同地区流行的ESBLs基因型有一定的差异。例如，日本以Toho-1型和SHV型为主[11]；美国以TEM-10、TEM-12和TEM-26为主[12]；非洲以TEM-53、TEM-63为主[13]；我国以CTX-M型为主，但其流行的亚型种类各异[14-15]。本研究表明，CTX-M型(81.63%)最普遍，TEM型次之(61.22%)，与蒋鸿超等[16]的报道相符。本研究中大部分临床分离菌株检出2种或2种以上的基因型(60.20%)，以TEM+CTX-M-9阳性组(30.61%)最常见，说明多重耐药在临床分离菌普遍存在。本研究除检测CTX-M、TEM和SHV型基因外，还进行CARB、LAP、KLSU、SCO、PER、GES、VEB等基因的扩增，但均为阴性，可能与ESBL基因型具有集中趋势及存在明显的地域差异相关，也可能与本研究所选取菌株数量有限相关。

整合子是存在于细菌质粒或染色体上基因捕获和表达的可移动遗传单位，由5′保守末端和3′保守末端及两者间的可变区三部分组成，可携带多种耐药基因盒，包括对氨基糖苷类、喹喏酮类、磺胺和消毒剂等耐药的基因，与细菌多重耐药和耐药基因的播散密切相关[10]。在大肠埃希菌的研究中目前发现了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类整合子，其中以Ⅰ类整合子最为常见[17]。本研究98株ESBL-EC 中47株携带Ⅰ类整合子(47.96%)，3株携带Ⅱ整合子(3.06%)，大多为多重耐药菌株，可见Ⅰ类整合子广泛存在于ESBL-EC菌株中，并可能影响其抗生素耐药水平。而本研究结果，对于ESBL-EC株，整合子阳性与整合子阴性除了对四环素和复方新诺明的耐药率差异具有统计学意义(P<0.05)外，对其他抗生素的耐药率差异均无统计学意义，尚不足以证明整合子的存在可影响ESBL-EC菌株抗生素耐药水平，这与国内报道[15-16]有一定的差异，可能与不同地区和医院所使用的抗生素种类、剂量及时间不同，造成对产ESBLs菌株的筛选及诱导不同，以及所收集的标本来源不一样等多方面原因造成的。

由于本研究收集的菌株仅来源于某三甲医院住院患者分离的标本，尚不能代表该地区的具体情况，关于整合子对ESBL-EC株耐药性的影响，还有待扩大样本，多收集几家三甲医院的菌株进一步对比研究，以增加说服力。同时，对整合子与ESBLs各基因型之间的关系及其在耐药传播中的具体作用还需进一步深入研究讨论，这对有效遏制耐药基因的传播以期达到控制多重耐药菌株的产生和播散具有深远的意义。

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