松乳菇Lactarius deliciosus与红汁乳菇L.hatsudake子实体内可培养细菌多样性的研究

王 冉, 于富强

(中国科学院 昆明植物研究所 资源植物与生物技术重点实验室，云南 昆明 650201)

真菌能否顺利侵染植物幼根并形成菌根，不仅取决于周围的非生物因素，如土壤pH值、肥力、湿度和温度等[1]，也受到一些生物因素，如微生物等[2]的影响。早在1979年，Bowen等[3]研究了不同外生菌根真菌与不同细菌之间的相互作用，实验表明土壤内微生物在真菌菌根形成过程中起着重要的作用。1994年法国学者Garbaye[4]首次提出了菌根促生细菌(Mycorrhiza helper bacteria,MHB) 的概念，MHB是指能够与菌根真菌特异性结合，并促进菌根真菌在宿主植物根部的定植和生长，进而间接地促进植物生长的细菌。这些微生物不仅存在于真菌与宿主植物形成的菌根中，还存在于真菌的子实体及其菌塘土壤中，它们直接或间接的影响着真菌菌根的形成、发育和发展。国内外学者在大型真菌相关的微生物研究方面开展了许多工作，Poole等[5]从红乳菇Lactariusrufus与樟子松形成的菌根中分离得到7种不同的细菌类群；Wan等[6]研究了国产白块菌子囊果内微生物的多样性；姜华等[7]从松茸的菌塘内分离到丰富的细菌类群；Kumari等[8]研究了鸡油菌的不同子实体内微生物，并获得变形菌门的多种细菌；另外，鹅膏属(Amanita)、黏滑菇属(Hebeloma)、蜡蘑属(Laccaria)和乳牛肝属(Suillus)等子实体内也被报道有多种细菌的存在[9-11]。乳菇属(Lactarius)隶属红菇目(Russulales)、红菇科(Russulaceae)，全球广布，能与松科、壳斗科、桦木科等经济树种形成外生菌根，是森林生态系统中的重要成员[12-14]。该属的一些种类在世界各地广为采食[15-16]，如松乳菇(L.deliciosus)、红汁乳菇(L.hatsudake)和橙黄乳菇(L.akahatsu)等，在云南乳菇因子实体含有丰富的乳汁，而被当地人称为奶浆菌。国内外开展了大量的乳菇菌根合成与人工栽培研究[17-18]，然而针对相关微生物的研究鲜见报道，鉴于微生物在菌根形成、发育、发展过程中的重要作用，本研究从乳菇子实体内分离，并对其多样性展开分析，为进一步研究细菌与乳菇的相互作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2015年6月29日于云南省昆明市茨坝农贸市场购买松乳菇(HKAS90710)和红汁乳菇(HKAS90711)样品，凭证标本存放于中国科学院昆明植物研究所隐花植物标本馆(HKAS)。

1.2 方法

1.2.1 分离与培养 在两种乳菇中分别挑选新鲜、无虫咬的4个子实体(松乳菇：L1a-L1d；红汁乳菇：L2a-L2d)，取菌盖与菌柄交界处菌肉0.5 g，放入灭菌的5 mL EP管内，加入0.85% NaCl 4.5 mL，用组织研磨仪充分打碎。将研磨后的菌肉组织置于28 ℃、120 r/min摇床培养箱中震荡培养30 min。取10-1g/mL菌液，将其稀释为10-2～10-6g/mL。选择10-2、10-3、10-4g/mL菌液进行涂布。不同浓度菌液各取100 μL在TSA培养基中(每种浓度各3个重复)用灭菌涂布棒进行均匀涂布，待菌液干后，将平板倒置于28 ℃培养箱中培养48 h。选择菌落数在30～300的平板，对其进行菌落计数。同时用灭菌的牙签挑取单菌落在1.5 mL TSB液体培养基中，28 ℃培养48 h。

1.2.2 NA提取与扩增 对TSB液体培养基中的细菌，5 000×g下离心10 min，弃上清液，加入TES buffer(20 mmol/L Tris, 50 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl，pH 7.9)，13 000×g下离心2 min；再加入1.2 mL TES buffer重悬；加入300 μL溶菌酶(5 mg/mL)裂解细胞，并将其置于37 ℃下60 min。16S rDNA扩增，扩增引物(上海生工)63f：5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′，1495r：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3′；25 μL PCR体系(宝生物工程)中包含1 μL DNA、1 μL引物(5 μmol/L)、2 μL 10× buffer (Mg2+free)、1 μL dNTP(10 μmmol/L)、0.5 μL BSA(1%)、1.5 μL MgCl2、0.3 UTaq酶；PCR条件为95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃10 min，共27个循环。

1.2.3 数据分析 使用BLAST对获得的序列与GenBank中的序列进行比对，相似度大于98%的作为一个OTU。使用ContigExpress拼接与编辑序列，在BioEdit v7.0.9中进行比对和自动排序，排好的序列用Mega 6.0中的Neighbor-Joining构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 细菌数量多样性

从4个松乳菇子实体内分离得到细菌66株10种6属，隶属于变型菌门的β-变形菌纲、γ-变型菌纲和拟杆菌门；4个红汁乳菇子实体内分离得到细菌48株7种7属，隶属于变型菌门的γ-变型菌纲、厚壁菌门和拟杆菌门。对不同子实体内分离得到的细菌CFU进行统计，结果显示(表1、表2)，松乳菇子实体内细菌数量为(3.9～5.0)×104cfu/g，对应的4个子实体内都有γ-变型菌门的细菌，子实体a和d中还分离得到拟杆菌门的细菌，此外除子实体b，其余子实体内都分离得到β-变型菌门的细菌；红汁乳菇子实体内细菌数量为(0.66～1.2)×104cfu/g，对应的4个子实体内都有γ变型菌门的细菌，子实体c中还分离得到厚壁菌门的细菌，而子实体b中则分离得到拟杆菌门的细菌。两种乳菇中γ-变形菌门细菌均为优势类群。

表1 松乳菇4个子实体内细菌计数

表2 红汁乳菇4个子实体内细菌计数

2.2 细菌种类多样性

2.2.1 松乳菇子实体内细菌16S rDNA系统发育树及多样性分析 从以Pyrococcusfuriosus为外类群构建的16S rDNA系统发育树上(图1)可以看出，松乳菇子实体内细菌分别很好的聚在了3大支内，包括变型菌门的β-变形菌纲、γ-变型菌纲和拟杆菌门。γ-变型菌纲为各子实体内的主要细菌类群，包括假单胞菌属Psedomonas、爱文氏菌属Ewingella、西地西属菌属Cedecea和Lelliottia，其中假单胞菌属为优势属，占细菌总数的51.1%，荧光假单胞菌Psedomonasfluorescens为该属中的主要种类(占该属细菌总数的47.1%)；爱文氏菌属、西地西属菌属和Lelliottia分别占细菌总数的13.64%、4.54%和7.57%。此外，松乳菇子实体内细菌还包括β-变形菌纲的Pandoraea(12.12%)和拟杆菌门的金黄杆菌属Chryseobacterium(10.6%)。

2.2.2 红汁乳菇子实体内细菌16S rDNA系统发育树及多样性分析 从以Pyrococcusfuriosus为外类群构建的16S rDNA系统发育树上可以看出(图2)，红汁乳菇子实体内细菌分别很好的聚在了3大支内，包括变型菌门的γ-变型菌纲、厚壁菌门和拟杆菌门。4个子实体内的细菌多样性都表现为γ-变型菌纲为主要细菌类群，在红汁乳菇子实体中，γ-变型菌纲包括了5个属的细菌，其中爱文氏菌属为优势菌属，占细菌总数的33.33%，但此属仅包括美洲爱文氏菌Ewingellaamericana一个种。另外γ-变型菌纲中还包括了假单胞菌属(16.67%)、Yersinia(8.33%)、泛菌属Pantoea(12.5%)和西地西属菌属(6.25%)。除了变型菌门，红汁乳菇子实体内细菌还包括厚壁菌门的芽胞杆菌属Bacillus(14.58%)及拟杆菌门的金黄杆菌属(8.33%)。

图1 基于松乳菇子实体内部分细菌16S rDNA构建的Neighbor-Joining进化树Fig.1 Neighbor-joining tree based on 16S rDNA gene partial sequences isolated from sporocarps of L. deliciosus每个支点迭代运算1 000次，序列Pyrococcus furiosus NR113294.1选作外类群，下图同The number at each branch node are bootstrap numbers from 1 000 re-samplings，the sequence of Pyrococcus furiosus NR113294.1 has been included as out group,same the follow

图2 基于红汁乳菇子实体内部分细菌16S rDNA构建的Neighbor-Joining进化树Fig.2 Neighbor-joining tree based on 16S rDNA gene partial sequences isolated from sporocarps of L. hatsudake

3 讨 论

子实体内特殊的微环境和营养结构，为特定细菌的生存繁衍提供了条件，特别是一些腐生或寄生型细菌。有研究表明，子实体内特定细菌的单位数量较周围土壤中的单位数量还要多，这些细菌可能是导致食用菌腐烂等病变的重要原因，在食用菌生活史中具有重要意义[19]。

本研究从松乳菇和红汁乳菇子实体中分离获得细菌，并对获得的细菌进行数量和种类多样性分析。从数量多样性可以看出，松乳菇子实体内细菌平均数量大于红汁乳菇子实体内细菌数量。两种乳菇分离到的细菌优势菌群都属于变型菌门的γ-变型菌纲，松乳菇中假单胞菌属为优势菌属，荧光假单胞菌为优势菌。前人的研究表明假单胞菌属Pseudomonas、芽胞杆菌属、类芽胞杆菌属Paenibacillus等都是外生菌根真菌中普遍存在的细菌类群[5，20-21]。Poole等[5]分离了红乳菇与樟子松形成的菌根中的微生物，其中优势菌包括伯克氏菌属Burkholderia和假单胞菌属的细菌；Wan等[6]从国产白块菌子实体内分离到的细菌中，优势菌属为假单胞菌属。作为优势菌种的荧光假单胞菌还是一种重要的植物病害生防菌和根际促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)，同时它对外生菌根真菌的生长也有一定作用。李守萍等[22]探讨了荧光假单胞菌与菌根真菌的互作关系，发现一定浓度的荧光假单胞菌菌液能够促进外生菌根真菌的生长，Sbrana等[23]研究表明被波氏块菌Tuberborchii侵染的欧洲栎Quercusrobur菌根上的细菌多为荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens和皱纹假单胞菌P.corrugata，此类细菌具有促进菌根真菌孢子萌发和菌丝体生长的作用。松乳菇中次生优势菌属包括爱文氏菌属、β-变形菌纲的Pandoraea、拟杆菌门的金黄杆菌属，这些细菌类群从其他真菌中也分离获得过。除了以上类群，从松乳菇子实体中还分离得到少量Lelliottia，此细菌在之前的研究中未被报道。

红汁乳菇中优势菌属为爱文氏菌属，此属在1983年由Grimont等提议为新属，美洲爱文氏菌为模式种Inglis等[24]从双孢蘑菇中获得美洲爱文氏菌，实验结果表明美洲爱文氏菌常出现于有病症的蘑菇中。但本研究挑选的实验材料都是健康、新鲜、无虫的。Kumani等[8]分离了不同采集地的鸡油菌子实体内细菌，从中也获得了美洲爱文氏菌，此菌株可能是专性生活在子实体内部的腐生型细菌。红汁乳菇中次优势菌属包括假单胞菌属、厚壁菌门的芽胞杆菌属、拟杆菌门的泛菌属。芽胞杆菌属主要包括的细菌为解淀粉芽胞杆菌，此细菌在自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物，这些代谢产物使解淀粉芽胞杆菌能够广泛抑制真菌和细菌的活性，可以适当代替传统的化学农药[25]。

本研究是从乳菇子实体内分离获得细菌。除了子实体，菌根真菌的菌根、根际土壤中都有着丰富的微生物群落。今后的实验将从以上方面获得细菌，并对不同来源的细菌进行差异性的比较。1994年Garbaye[4]首次提出菌根促生细菌(MHB)的概念，细菌多样性的研究将为进一步获得MHB提供理论基础。继续研究乳菇菌根、根际土壤内的微生物多样性，并通过进一步实验获得菌根促生细菌，这是未来实验的主要方向。

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