乳制品中胶原蛋白检测方法的研究

李春梅，侯典朋，王丹，任璐瑶，沈思宇

（1.黑龙江省绿色食品科学研究院,哈尔滨 150028；2.黑龙江东方学院食品工程，哈尔滨 150066；3.吉林大学食品加工与安全，长春 130012）

0 引 言

近些年来，随着胶原蛋白提取技术的发展，胶原蛋白越来越受到普通大众的关注。作为生物体内含量最多的一种蛋白质，可以应用到乳及乳制品、保健品、化妆品、医学等领域，应用范围多样化导致其有很好的发展前景。胶原蛋白是一种不透明、白色、无支链的纤维蛋白质，分布在动物全身各个组织器官，如骨骼、韧带、皮肤、软骨等，约占总蛋白质的25%～35%[1-2]。胶原蛋白的氨基酸组成因来源和蛋白质类型不同而有所差异[3]，但大致的氨基酸组成相同,羟脯氨酸是胶原蛋白特有氨基酸，用羟脯氨酸的量乘以相对应的换算系数就得到胶原蛋白的含量[4]。近年来，市面上的胶原蛋白产品琳琅满目，胶原蛋白在乳制品方面应用的也很广，乳制品中蛋白的检测主要方法是国标的凯氏定氮法，但是对于乳制品中胶原蛋白的检测还未有标准，因此根据市场的需求研究开发一种胶原蛋白的检测方法是具有十分重要的意义。

1 胶原蛋白

1.1 胶原蛋白的种类

目前已发现27种不同类型的胶原蛋白,依照发现的先后顺序采用罗马数字命名为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原蛋白等，其中含量最多的以Ⅰ型胶原蛋白为主，占全部胶原蛋白含量的90%以上[5-6]。按构成组织可分为纤维状胶原、软骨质胶原、玻璃状胶原、弹性胶原等[7]。根据在体内的功能和散布特点,可将胶原蛋白分成间质胶原、基底膜胶原、细胞外周胶原。

1.2 胶原蛋白的来源

胶原蛋白的来源很多，以前主要来源于猪、牛的皮和骨骼等。但由于疯牛病、口蹄疫爆发，开始采用鱼的骨、鳞、皮作为制备胶原蛋白的主要原料[8-10]。人们也开始从其他加工副产物中提取胶原蛋白，如Cli⁃che J[11]利用胃蛋白酶对鸡皮进行消化处理得到胶原蛋白，结果可以获得纯度为74.4%的Ⅰ型胶原蛋白。李小勇等人按GB9695.23-90《肉和肉制品中L(-)-羟脯氨酸含量测定》从猪肺中提取出HYP，通过转换系数最后得出胶原蛋白含量在3.0%～3.2%之间。

1.3 胶原蛋白的应用

胶原蛋白可用于纯牛奶、酸奶、中性奶饮料等液态乳制品中，不但保持原有的各种生理功能，还对乳制品品质有一定的改善作用[12]。在褐色乳饮料中添加胶原蛋白具有乳化稳定、提高口感和改善风味的作用。Riichiro O[13]在保健品中加入了胶原蛋白，能非常有效地增加皮肤组织细胞的储水能力，加强和维持肌肤良好的弹性、增加肌肤的韧性、延缓肌体的衰老。胶原蛋白具有良好的生物学特性，可用于组织修复、创伤、烧伤等医学领域[14-15]，如Rafiuddin M等人[16]通过胶原蛋白研制成的交联管状神经导管成功实现了神经再生。胶原蛋白同样也具有生物相溶性、生物降解性、细胞适应性、细胞增殖作用及促进血小板凝聚等生物学性质[17]。

2 胶原蛋白检测方法的国内外研究现状

2.1 分光光度法

分光光度法是利用物质对某种光的波长具有选择性吸收的特性，来对物质本身进行定性以及定量分析的方法。此方法应用范围广泛，对实验室仪器设备要求较低，可以在普通实验室和企业应用，但是特异性、灵敏度和准确性相对较差，测量结果也容易受多种因素的影响。Heng-bin G[18]用分光光度法检测鱼皮中胶原蛋白的含量，结果表明不同鱼皮的胶原蛋白含量不同。此方法可以用来测定鱼皮中胶原蛋白含量，以便于鱼皮中胶原蛋白的进一步开发和利用。Lins[19]依据胶原蛋白水解的游离氨基酸中特有的HYP，测定其含量以计算胶原蛋白的含量，但其水解和衍生过程繁琐且HYP含量随生长期不断变化，所以不是所有来源的胶原蛋白都有确定的转换系数。张笑通过分光光度仪对乳制品中的羟脯氨酸含量进行测定，从而得知乳制品中是否添加了水解蛋白。

2.2 液相色谱法

高效液相色谱在实验室已越来越普及，具有灵敏度高、重现性好，适用样品范围广等特点，但是样品需要衍生，步骤繁琐易造成衍生不完全的情况发生。Nagai T[20]等人为提高水产品中胶原蛋白的利用率，采取柱前衍生-高效液相色谱法对鲫鱼不同组织中的L-羟脯氨酸含量进行检测，此方法可应用于不同水产品的组织中胶原蛋白的定量分析。Green GD[21]从胶原蛋白的组织提取物或溶液中测定羟脯氨酸的含量，最后得到胶原蛋白的浓度。Hu H等[22]为了区分酱油中是否添加酸水解蛋白液，通过液相色谱法检测酱油样品中HYP含量，在波长360 nm下检测，HYP的峰面积和质量浓度在10～320 mg/L范围内线性关系良好，相关系数为0.9992，回收率为97.2%～110.2%，LOD为2.5 mg/L。因此得出，如果在酱油中检测有HYP的存在，说明在酱油样品中添加了水解植物蛋白或水解动物蛋白。高效液相色谱法同样也适用于乳及乳制品中羟脯氨酸的检测，姜维等将乳制品中的胶原蛋白水解成HYP等氨基酸混合物，测定混合氨基酸中HYP的含量。

2.3 电泳法

该方法要求羟脯氨酸在柱前具有电活性，所以需将L-羟脯氨酸衍生，使其带有一定的电荷，再进行检测。适用于胶原蛋白种类的分析分离技术，具有进样量少、分辨率高、绝对灵敏度高的优点，但是操作较为繁琐。Mazorra-Manzano MA等[23]实验研究开发一种通过毛细管电泳（CE）测定肉制品中羟脯氨酸含量的方法，从而得出胶原蛋白的量。Qiu H[24]等利用凝胶电泳法研究了C射线外照射对皮肤等组织中胶原代谢指标的影响,利用该方法分离出分子量相近的胶原蛋白的含量。ONOUMA等[25]利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定黄鳍金枪鱼鱼鳔胶原蛋白的分子量，进而推测胶原蛋白的含量。Liang等[26]以磷酸盐作为缓冲液，采用电泳法测定尿液中的HYP，浓度在1.3～262.0mg/L范围内线性良好，回收率为96.4%～101.2%，HYP的LOD为0.5mg/L。

2.4 氨基酸自动分析仪法

该方法样品处理操作简单，误差小和自动化程度高，能准确、快速地检测出胶原蛋白水解物中L-羟脯氨酸的含量，又可同时测定出其他16种水解氨基酸，但是此方法成本相对较高，分析耗时太长，所以在基层实验室不好普及。PRABJEET等[27]用氨基酸自动分析仪分析了巴丁鱼皮中提取的酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白的氨基酸组成，从而得知L-羟脯氨酸的含量。Johnson RG[28]快速、准确地测定糖胺聚糖(GAG)和胶原蛋白含量，分析了胶原蛋白结缔组织类型，从羟脯氨酸和羟赖氨酸值比计算胶原蛋白含量和测定胶原蛋白类型。Cai M等[29]运用氨基酸自动分析仪快速测定牛乳中L-羟脯氨酸的方法，浓度0.05～1.0mmol/L范围内吸收度呈良好线性关系，平均回收率为91.5%，方法精密度为1.3%，最低检出限0.66 mg/L。Messia等[30]报道了利用氨基酸自动分析仪测定猪肉及猪肉制品中HYP的含量，方法回收率为97%～104%，RSD小于6.4%，此方法也可用于乳及乳制品中HYP的检测，最后得出动物水解蛋白含量。氨基酸自动分析仪法同样适用于乳与乳制品中是否添加动物胶原水解蛋白的鉴定，如曾暖茜等利用氨基酸自动分析仪准确地测定乳制品中HYP含量，张秀尧将乳制品酸水解后直接用氨基酸自动分析仪检测。

2.5 质谱检测法

此方法流动相简单，分析时间短且无需衍生处理，抗干扰能力强，能准确快速地测定胶原蛋白的含量，但是仪器设备昂贵，检测成本相对较高。Zheng YF等[31]通过高效液相色谱——质谱联用测定乳制品中是否掺加了胶原蛋白，可用于质量监督部门的乳制品质量安全监督检验。Nimptsch A等[32]基于质谱法是利用酶法将胶原蛋白酶解成多肽片段，Gly-Pro-Hyp是胶原蛋白特异性肽段，对胶原蛋白进行定量分析。Colgravea等[33]用质谱检测法测定绵羊半膜肌中的HYP含量，HYP的浓度在4.9～5000 nmol/L范围内线性良好，回收率在90%～108%之间，其LOD为640 mg/L，从而得出绵羊半膜肌中胶原蛋白的含量。质谱检测法被刘思洁等人制订为吉林省地方标准（乳与乳制品中羟脯氨酸的测定DB S22/010-2012），对乳与乳制品中HYP进行检测。

2.6 离子色谱法

离子色谱法有分析速度快、样品用量少、多组分同时分析等优点，但是定性分析能力相对较差，不适合乳与乳制品中胶原蛋白的分析。Avery NC[34]实验研究利用离子色谱法测定胶原蛋白的含量，证明胶原蛋白具有一定的支撑作用。Yiping Z等[35]人利用离子色谱法测定鱼鳞胶原蛋白中L-羟脯氨酸的含量，为工艺研究提供检测理论依据，同时可作为判断鱼鳞胶原蛋白含量的一个定量指标。

2.7 免疫学检测法

免疫学检测法的原理是通过抗原和抗体特异性结合后出现的各种现象，借助电子显微镜观察其结果，来对样品进行定性及定量检测。免疫学检测法包括多种：如酶联免疫检测法、免疫电镜法、放射免疫法、PV法[36]、免疫荧光法、免疫印迹法、ELISA间接法测定Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、双抗体夹心ELISA法测定血清Ⅳ型胶原蛋白。其中ELISA检测法比较常用，是将胶原蛋白作为抗原与抗体结合再与辣根过氧化物酶（Horse radish peroxidase,HRP）或碱性磷酸酶（Al⁃kaline phosphatase，AKP）偶联的抗体结合，经化学显色反应，检测显色底物的吸光度值即可确定胶原蛋白的相对含量，但其每一步都需洗涤，过程较长并不适于组织分析[37]。

2.8 天狼星红法

天狼星红法是通过天狼星红可以与胶原蛋白发生特异性结合，经过NaoH溶液对其进行洗脱和离心，得到红色复合物，通过分光光度仪测定吸光度从而确定胶原蛋白含量。Pilar等[38]通过天狼星红法评估组织中胶原蛋白含量，该方法是基于Sirius红与固定在PVDF膜上的样品中存在的胶原蛋白的结合，并且通过扫描仪和图像分析软件确定胶原蛋白含量。此方法需要无氧介质或昂贵的设备和大样本的要求，不适合乳与乳制品中水解胶原蛋白和组织分析。

2.9 传统的干重法

传统的干重法是将原料进行一系列加工处理，从中提取出杂胶原蛋白，经冻干得到胶原蛋白，最后测干重分数，过程非常繁琐且灵敏度相对较低[39-40]，不适合乳与乳制品中胶原蛋白的检测分析。

3 结束语

近年来，许多研究人员对胶原蛋白的检测做了深入细致的研究，总结出许多不同的方法，每种方法都有其优点和缺点，现有检测乳与乳制品中胶原蛋白的方法都需要一定的仪器设备，难以满足现场进行快速检测，因此将来需要研制出更加快捷、准确，经济的检测手段（如测试片、试纸条等）。目前所采用的主要方法为高效液相色谱法，该方法国内外应用最为广泛，适用于乳制品及胶原蛋白等产品。检测胶原蛋白的所有方法都是测定其中L-羟脯氨酸的含量，再乘以相对应胶原蛋白换算系数，最后得出胶原蛋白的总量。对于胶原蛋白中含L-羟脯氨酸的比例系数，不同物种互不相同，即使同种生物不同部位也存在差异，导致没有一个规范的数值，因此对胶原蛋白换算系数引用混乱。根据相关资料报道：猪骨6.12～6.17、猪皮10左右、鸡骨6.27～6.30、羊骨6.34～6.35、牛骨6.77左右、牛皮7.94～8.85、深海鱼皮16.67左右、淡水鱼皮10.41～11.36、淡水鱼鳞12.5左右、鲟鱼鳍9.01左右、林蛙皮6.49左右等。所以，寻找更加简便、准确地胶原蛋白检测方法应为国内外学者的研究方向。

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