抗菌肽等抑菌物质抗菌活性检测方法比较研究

田娜娜，郭子璇，王璐，李志成

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

0 引 言

抗菌肽抗菌活性测定方法有很多，目前国内外学者多采用扩散法进行抗菌肽活性的检测[1-5]。扩散法中的打孔法灵敏度高，抑菌圈规则清晰，效果好，但却较为耗时[6]。生长在培养基中的菌种接触到不同的抗菌肽等抑菌物质，会形成大小不同的抑菌圈，根据抑菌圈的大小，则可以判断出此种抑菌物质的抗菌活性。同理，在菌悬液中加入不同浓度的抗菌肽等抑菌物质，根据其吸光度的大小，可以判断该物质的抗菌活性。抑菌物质的发现与应用成功地预防和治疗了微生物引起的疾病的传播，现正在以惊人的速度被添加到家庭的日用品和医药、保健品当中[7-8]。抗菌肽作为一类抑菌物质，在医药领域、食品领域和畜牧产业中成为了研究的热点[9-12]。因此，如何快速而简便的测定抗菌肽等抑菌物质的抗菌活性也就成为一个重要的问题。

本文选取大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌三种常见的菌种，分别采用抑菌圈法和分光光度法对不同浓度的Nisin溶液进行抗菌活性检测，从而建立了上述两种方法间的联系，为快速而简便的检测抗菌肽等抑菌物质的抗菌活性提供了依据。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

大肠杆菌（Escherichia coliATCC25922）、沙门氏菌（SalmonellaLT2）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aures26111），西北农林科技大学食品科学与工程学院保藏；牛肉膏、蛋白胨、营养琼脂为生化试剂；乳酸链球菌素（Nisin）、茶多酚和聚赖氨酸为食品级；盐酸、无水乙醇、NaOH和NaCl为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1700紫外可见分光光度计，PB-10型数显酸度计，SW-CJ-IF超净工作台，F1-45恒温培养箱，SL502N高压蒸汽灭菌锅。

1.3 方法

1.3.1 培养基的制备

参照苏晋文的方法制作[13]。简述如下，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，加入5%的NaOH溶液，使其pH为7.4～7.6，于121℃高温灭菌15 min，备用。固体培养基加入12 g琼脂。

1.3.2 菌液的制备及标准曲线的建立

在无菌条件下，采用划线法将甘油保藏的菌种于斜面培养基上连续活化2次。用接种针勾取活化后的新鲜菌落放入100 mL培养液中，摇匀混合液，放置在37℃下培养24 h，再用无菌培养液将其稀释至107CFU/mL备用。通过测定大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌菌液吸光度和菌液浓度建立标准曲线[13]，如图1所示。

图1 菌液吸光度与其浓度的标准曲线

1.3.3 抑菌圈法与分光光度法检测抑菌物质的抗菌活性试验

用无菌水配制质量浓度为0.20 g/L、0.40 g/L、0.60 g/L、0.80 g/L、1.00 g/L的Nisin溶液[14]，选取大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为试验菌种，采用抑菌圈法和分光光度法检测Nisin溶液的抗菌活性，得出抑菌圈直径比和抑菌率，建立抑菌圈法和分光光度法的关系。最后配制浓度梯度均为0.5 g/L、1.0 g/L和1.5 g/L的茶多酚溶液和聚赖氨酸溶液[14]，用相同的方法获得其抑菌圈直径比和抑菌率，建立抑菌圈法和分光光度法的关系。

1.3.3.1 抑菌圈法检测Nisin溶液的抗菌活性试验

在无菌条件下，取107CFU/mL菌液100 μL，用玻璃刮板均匀涂布于营养培养基的表面，大约20 min后菌液被吸收，用外径为8 mm的无菌小钢管在琼脂平板上打孔，每孔加入80 μL的Nisin溶液，水平置于4℃冰箱中，待Nisin溶液完全扩散后（约2～3 h后），再移至37℃恒温培养箱中倒置培养24 h，观察结果。每组做3个平行，最后取平均值。以等量的0.85%（g/mL）生理盐水作阴性对照组，以等量的0.64 mg/mL青霉素钠作阳性对照。当样品出现抑菌圈，以游标卡尺量取其抑菌圈的直径，直径的大小代表其抑菌活性的大小[15]。

抑菌圈直径比按照公式（1）计算：

1.3.3.2 分光光度法检测Nisin溶液的抗菌活性试验

参考尹宁、潘晓倩[6,16]的方法，略作修改。分别取活化后菌液浓度为107CFU/mL的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌菌液10 mL，加到10 mL 0.20 g/L、0.40 g/L、0.60 g/L、0.80 g/L和1.00 g/L的Nisin溶液中。在阴性对照组中分别加入相应体积的三种菌液和0.85%（g/mL）的生理盐水，阳性对照组中分别加入同样体积的三种菌液和0.64 mg/mL的青霉素钠溶液，均在37℃恒温培养箱中培养24 h，然后在600 nm处测定菌液的吸光度OD600，每组做3个平行，求平均值。

菌液培养前后吸光值的变化：

抑菌率按照公式（2）计算：

2 结果分析

2.1 Nisin溶液对不同菌种的抑菌效果

目前没有采用抑菌圈法检测抑菌物质抗菌活性的国家及行业标准，加在琼脂孔内或纸片上样品量50～1000 μL不等[17-19]，琼脂孔或纸片的直径大小不一，5～15 mm均有[20-22]，这样，仅用抑菌圈的直径比较抑菌物质的抗菌活性显得不够严谨。因此，提出用抑菌圈直径比代替抑菌圈直径表示抑菌圈法测定抑菌物质的抗菌活性。

表1 Nisin对不同菌种抑菌圈直径比的影响

本试验比较了不同质量浓度Nisin对三种菌种抑制作用形成的抑菌圈直径和抑菌圈直径比的大小。Nisin对不同菌种抑菌活性的影响见表1。由表1可知，对于大肠杆菌和沙门氏菌，随着Nisin溶液浓度的增加，抑菌圈直径和抑菌圈直径比也逐渐增加。对于金黄色葡萄球菌，Nisin溶液浓度在0.20～0.60 g/L时，抑菌圈直径和抑菌圈直径比随着Nisin浓度的增加而增加，Nisin溶液浓度在0.60～1.00 g/L时，抑菌圈直径和抑菌圈直径比的变化不大，这与李金春等研究Nisin对金黄色葡萄球菌的致死作用中的结果基本一致[23]，即Nisin的浓度范围在0～0.4 g/L，随着Nisin浓度的增加，对金黄色葡萄球菌的致死量显著增加，Nisin浓度超过0.4 g/L，金黄色葡萄球菌致死量变化趋于平稳。对于这三种菌种，Nisin对金黄色葡萄球菌的抑制作用最小，抑菌圈直径和抑菌圈直径比最小。

根据潘晓倩等的研究[6]，与本试验相比，加在琼脂孔内样品量不等，琼脂孔的直径均为8 mm，形成的抑菌圈直径不同，得出的抑菌圈直径比也不同，这种现象出现的原因可能是所用Nisin溶液的活性不同。

2.2 不同菌种抑菌圈法和分光光度法的关系

2.2.1 大肠杆菌

图2 Nisin的抑菌率与其抑菌圈直径比的关系（大肠杆菌）

由图2可以看出，随着抑菌率的增加，抑菌圈直径比也按照一定比例增加。对于大肠杆菌，检测不同浓度Nisin溶液抑菌效果的抑菌圈法和分光光度法之间存在指数关系，关系式为y=1.6329e0.0015x。分别检测茶多酚溶液和聚赖氨酸溶液对大肠杆菌的抑菌效果，见图3。由图3可知，茶多酚和聚赖氨酸对大肠杆菌的抑菌率和抑菌圈直径比的关系均为二次多项式关系。根据以上关系式可以反推其抑菌圈直径比和抑菌圈的直径。例如当Nisin、茶多酚和聚赖氨酸对大肠杆菌的抑菌率均为80%时，代入公式y=1.6329e0.0015x、y=0.0087x2-1.4783x+64.8和y=0.0003x2-0.0301x+2.5936中，可以得到抑菌圈直径比分别为1.841、2.216和2.1056，若琼脂孔或纸片的孔径直径为8 mm，那么可得出抑菌圈直径分别为14.728 mm、17.728 mm和16.845 mm。

图3 茶多酚和聚赖氨酸的抑菌率与其抑菌圈直径比的关系（大肠杆菌）

2.2.2 沙门氏菌

图4 Nisin的抑菌率与其抑菌圈直径比的关系（沙门氏菌）

由图4可知，Nisin对沙门氏菌的抑菌率在40%～70%的范围内增加时，其抑菌圈直径比快速增大，此后抑菌圈直径比随抑菌率的增加而缓慢增加。对于沙门氏菌，加入不同浓度Nisin溶液，其抑菌圈法所得到的直径比与分光光度法得到的抑菌率之间存在三次多项式的关系，关系式为y=0.000003x3-0.0007x2+0.0638x+0.0126。分别检测茶多酚溶液和聚赖氨酸溶液对沙门氏菌的抑菌效果，见图5。由图4和图5可知，随着Nisin、茶多酚和聚赖氨酸对沙门氏菌抑菌率的增加，抑菌圈直径比呈增加趋势，存在多项式关系。当Nisin、茶多酚和聚赖氨酸对沙门氏菌的抑菌率分别为70%、95%和50%，此时的抑菌率直径比分别为2.0776、2.2559和1.8327。

图5 茶多酚和聚赖氨酸的抑菌率与其抑菌圈直径比的关系（沙门氏菌）

2.2.3 金黄色葡萄球菌

图6 Nisin的抑菌率与其抑菌圈直径比的关系（金黄色葡萄球菌）

由图6知，抑菌圈直径比随着抑菌率的增加而增加。当抑菌率小于40%，抑菌圈直径比的增加缓慢；当抑菌率大于40%，抑菌圈直径比随抑菌率的增加而上升较快。在不同浓度Nisin溶液对金黄色葡萄球菌的抑制试验中，抑菌圈直径比与抑菌率之间存在二次多项式关系，关系式为y=0.00008x2-0.003x+1.0526。分别检测茶多酚溶液和聚赖氨酸溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，见图7。由图6和图7可知，对于金黄色葡萄球菌，Nisin、茶多酚和聚赖氨酸对其抑制所形成的抑菌率和抑菌圈直径比的关系分别为二次多项式、线性和二次多项式关系，并且随着抑菌率的增加，抑菌圈直径比呈现出上升的趋势。在钱丽红[24]等的研究中测得2 g/L的茶多酚对金黄色葡萄球菌的抑菌率为45.2%，代入茶多酚对金黄色葡萄球菌的抑菌率和抑菌圈直径比的公式y=0.0101x+0.5189中，可得到抑菌圈直径比为0.9754，进而可得到不同孔径下的抑菌圈直径。

图7 茶多酚和聚赖氨酸的抑菌率与其抑菌圈直径比的关系（金黄色葡萄球菌）

因此，对于确定的菌种来说，通过建立某抑菌物质的抑菌圈法与分光光度法之间的关系，可以用分光光度法快速而简便的测定某抑菌物质的抗菌活性。

3 结论

不同浓度的Nisin溶液对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，其抑菌圈直径比与其抑菌率之间分别存在指数、三次多项式和二次多项式关系。Nisin溶液对不同菌种抑菌效果的抑菌圈法与分光光度法之间的关系不同，但对于同一菌种，Nisin溶液抑菌效果的抑菌圈法与分光光度法之间的关系是确定的。经验证，茶多酚和聚赖氨酸同样适用以上规则。对于确定的菌种来说，通过建立某抑菌物质的抑菌圈法与分光光度法之间的关系，就可以用分光光度法快速而简便的测定某抑菌物质的抗菌活性。本文首次建立起抑菌圈法与分光光度法的联系，提供了一种测定抑菌物质抗菌活性的新思路，可以通过较为简单的操作得到更为直观、可信的结果。

本试验主要对常见的大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌进行验证，抑菌圈法与分光光度法之间的关系是否可应用于其他菌种仍有待进一步的验证。

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