QuEChERS EMR-Lipid技术结合LC-QTOF快速筛查与确证液体乳中兽药残留

张凤艳,蒋万枫,王锡青

（1.青岛市食品药品检验研究院，山东 青岛 266071;2.青岛圣元营养食品有限公司，山东 青岛 266000)

0 引 言

兽药已广泛应用于奶牛养殖业中，一定量的兽药使用可以预防和治疗奶牛疾病，减少奶牛养殖企业的损失，但是若使用不当或过量使用、甚至违法使用会引起牛奶药物过度残留，并通过食物链进入人体，导致人体产生抗药性、过敏反应等，严重的可诱导疾病的发生，从而危害消费者健康，尤其是婴幼儿、老年人、患有疾病的特殊人群，可能会造成更大的危害。更有甚者，部分不法分子将人用抗生素用到奶牛上，导致了牛奶兽药残留问题愈加复杂。因此，评估和监管兽药在液体乳中的药物残留对保护消费者的权益和食品安全具有积极意义[1]。

目前，兽药残留广泛采用的检测仪器设备为三重四级杆质谱，具备检出限低和灵敏度高等优势，可同时定量测定几类药物，但不能对化合物进行精确相对分子质量和断裂途径的测定[2-5]。四级杆-飞行时间质谱属于高分辨质谱，能测定得到精确质量数（精确到小数点后4位），还可通过数据库进行一级和二级质量数匹配以确证化合物的存在，已广泛应用于农药残留、兽药残留检测中[6-8]。不仅能检测规定的兽药检测项目，而且还能在没有标准品的情况下筛查未知化合物。

牛奶中富含脂肪、磷脂、蛋白等基质干扰物质，样品前处理直接影响检测结果。目前兽药残留检测的净化方法主要采用固相萃取法[3-7]、QuEChERS[2,8,9]方法等。有别于现有方法，本文采用的QuEChERS EMR-Lipid技术进行前处理，特殊聚合物基质EMR专门吸附脂质中C5及以上的碳链，对脂质具有非常强的选择吸附性，这样在除掉基质干扰物的同时也不会吸附分析物。以往的样品前处理吸附剂以硅胶基质为主，上面键合C18或者是其它一些固定相，针对性差，对样品的回收率也较低，不但处理时间长而且也是误差的一个较大来源[10]。检测仪器采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱，通过建立的筛查数据库，可以对未知化合物进行快速筛查与鉴定。

1 实 验

1.1 仪器及设备

Agilent 1290超高效液相色谱仪，G6530A Q-TOF四极杆飞行时间质谱仪，配有Dual Agilent Jet Stream Electrospray Ionization(Dual AJS ESI)源(美国Agilent公司)；MultiReax漩涡振荡器(德国Heidolph公司)，3-30KS冷冻离心机（德国Sigma公司），Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)，XS205Du电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 试剂、药品及材料

兽药标准品:纯度≥95%(Dr.Ehrenstorfer GmbH)；乙腈甲醇均为色谱纯(德国默克公司)；除脂分散净化包（安捷伦Bond Elut dSPE Enhanced Matrix Removal(EMR)-Lipid）；除脂萃取盐包（Bond Elut EMR-Lip⁃id?Polish Pouch,anhydrous MgSO4 only）；陶瓷均质子（适合于50 mL离心管，安捷伦）。

1.3 样品前处理

称取牛奶样品5 g（精确至0.01 g）,于50 mL具盖离心管中,加入10.0 mL 5%甲酸乙腈提取液及两粒陶瓷均质子，涡旋（2 000 rpm）混匀5 min，离心5 min(4 000 rpm)。移取5.0 mL醋酸铵水溶液（5 mmol/L)到15 mL EMR-Lipid dSPE管中，快速振摇并涡旋2 min（2 000 rpm）。移取5.0 mL离心后上层提取液到经过活化的EMR-Lipid dSPE管中，快速振摇并涡旋2 min（2 000 rpm），离心5 min(4 000 rpm)。将上层液完全倾倒入50.0 mL离心管中，加入两粒陶瓷均质子及EMR pol⁃ish粉包，快速剧烈振摇并涡旋2 min（2 000 rpm）。离心5 min(4 000 rpm)，移取上层乙腈溶液，待分析。

1.4 色谱条件

色谱仪:Agilent 1290 Infinity LC；色谱柱:ZORB⁃AX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；柱温:30℃；流速:0.4 mL/min；进样体积:5 μL；流动相:A:0.1%甲酸水，5 mmol乙酸铵(ESI+)，B:甲醇。洗脱条件:0～1 min，95%A，1～8 min，95%～50%A，8～14 min，50%～5%A，14～18 min，5%～2%A，18～19.5 min，2%～95%A，保持95%A 0.5 min，等待下一次进样。

1.5 质谱条件

质谱仪:Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF；离子源:双喷射离子源Dual AJS ESI；雾化气:40psi；干燥气温度:325℃；干燥速率:7 L/min；鞘气温度:350℃；鞘气流速:11 L/min；毛细管电压:3 500V；喷嘴电压:0V（ESI+）；碰撞解离电压:135V；扫描范围:100～1 000 m/z，二级质谱扫描范围和碰撞电压分别根据待测目标化合物设定；采集速率:一级1.5 spectra/s，二级5 spectra/s。

2 数据分析

2.1 数据分析软件

数据分析软件Mass Hunter Qualitative Analysis B06.0.633.0，分子结构解析软件Mass Hunter MSC B05.00，数据库建立通过Agilent Mass Hunter PCDL Manager(B.04.00)软件完成。

2.2 一级筛查库建立

本文根据农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》、国内外兽药使用和残留限量的相关标准。最终确定了134种常用药物进行筛查，分别为：乙酸丙嗪、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑、阿苯达唑氨砜、四烯雌酮、金刚烷胺、羟氨苄青霉素、羟氨苄青霉噻唑酸、去羟基氨苄青霉噻唑酸、氨苄青霉素、氨苄青霉噻唑酸、去羟氨苄青霉噻唑酸、去甲雄三烯醇酮、阿托品、阿扎哌隆、阿奇霉素、坎苯达唑、咔唑心安、头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑啉、头孢匹罗、头孢喹肟、头孢洛宁、金霉素、氯丙嗪、西诺沙星、环丙沙星、克仑特罗、克仑塞罗、克仑潘特、克林霉素、邻氯青霉素、氯唑西林、邻氯青霉噻唑酸、去羟邻氯青霉噻唑酸、达氟沙星、地美环素、地塞米松、地西泮、双氯西林、二氟沙星、强力霉素、氟哌利多、红霉素、泛昔洛韦、非班太尔、芬苯哒唑、氟罗沙星、氟苯达唑氨基代谢产物、氟甲哇、氟轻松、依诺沙星、恩诺沙星、氟哌啶醇、异丙硝唑、交沙霉素、洛美沙星、马普特罗、马喷特罗、麻保沙星、甲苯哒唑、甲苯哒唑羚基代谢产物、甲苯哒唑氨基代谢产物、甲地孕酮、美仑孕酮乙酸酯、甲硝唑、甲基强的松龙、萘夫西林、诺氟沙星、奥比沙星、奥芬达唑、奥苯达唑、氧氟沙星、苯唑西林、土霉素、喷布洛尔、苄青霉素、苄青霉噻唑酸、去羟苄青霉噻唑酸、奋乃静、培氟沙星、青霉素、毗呱酸、哌拉西林、泼尼松龙、孕酮、莱克多巴胺、班布特罗、倍氯米松、倍他米松、利巴韦林、罗红霉素、溴布特罗、沙拉沙星、司帕沙星、螺旋霉素、康力龙、苯甲酸磺胺、磺胺醋酸、磺胺喹恶琳、磺胺氯哒嗪、磺胺氯毗嗪、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嗪、周效磺胺、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲恶唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、柳氮磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺二甲异唑、左旋咪唑、特硝唑、睾酮、四环素、噻苯咪唑、5-羟基噻苯咪唑、泰妙菌素、替硝唑、群勃龙乙酸酯、甲氧苄啶、妥布特罗、泰乐菌素、甲苯噻嗪、赛拉嗪。建立了134种兽药一级质谱扫描筛查库。通过库检索，以目标化合物的一级质谱精确分子量、同位素丰度匹配、特征离子等信息进行定性分析。

2.3 二级谱库建立

将实验室已有的标准品配制成1 mg/L的混合标准溶液，进行一级采集，通过一级数据库进行检索，确定母离子和保留时间，重复测定，在Targeted MS/MS采集界面输入兽药的母离子，保留时间，优化碰撞能量，得到母离子不消失，子离子丰富的二级谱图，再将其导入PCDL软件中，建立二级离子碎片特征谱图谱库。

3 结果与分析

3.1 流动相的选择

多兽药残留的筛查，需要一个相对平缓的液相洗脱梯度，使所需要检测的各种兽药在色谱柱中有所保留并与基质极性化合物分开，减小基质对分析物以及各分析物之间的干扰。本文采用起始为95%水相，在18 min内缓慢变化到2%水相的大梯度的洗脱方式，尽可能使各种目标兽药分析物具有较好的分离度。本文比较了0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸铵）-乙腈和0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸铵）-甲醇4种流动相体系对分离效果的影响。经过实验，最终确定了0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸铵）-甲醇作为流动相，添加5 mmol/L乙酸铵可以有效抑制兽药在离子源中生成[M+Na］+峰，显著增强［M＋H］+信号，从而提高了检测的灵敏度和稳定性，也有利于使用MSC软件进行结构解析。一级总离子流图见图1。

图1 样品一级总离子流图

3.2 净化条件的优化

通常QuEChERS方法，采用纯乙腈作为提取液，本文对比了5%甲酸乙腈和纯乙腈提取效果。在20 μg/kg、40 μg/kg和80 μg/kg 3个添加水平下，在空白基质中添加40种常见兽药，乙腈为提取溶液时，目标化合物的回收率为24.2%～96.3%。5%甲酸乙腈为提取溶液时，目标化合物的回收率为68.2%～129.1%。结果表明5%甲酸乙腈提取液的提取效果较好，回收率较高。同时，对EMR粉末的活化条件也进行了优化，分别考察了5 mmmol/L醋酸铵水溶液、水、5%甲酸、5%醋酸等4种活化溶液的效果，最终选择5 mmol/L醋酸铵水溶液。

3.3 方法学确证

取空白纯牛奶样品，选取40种不同性质兽药进行方法学验证，按1.3节样品预处理方法进行处理净化，测定目标分析物相应强度。以分子离子峰面积Y对含量X(μg/L)作标准曲线。用基质提取液稀释标准曲线的最低浓度，直到获得每种兽药的信噪比大于等于10(S/N≥10)的最低浓度，确定其为该化合物的定量限(LOQ)。在20 μg/kg、40 μg/kg和80 μg/kg 3个添加水平下，在空白基质中添加40种常见兽药，进行筛查确证，每个浓度水平取6份样品进行试验，计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)。经验证，各兽药相关系数大于0.99，LOQ为1～100 μg/kg；回收率为68.2%～129.1%，RSD为2.8%～30.8%。结果表明，本文建立的方法灵敏度、准确性和重复性良好，能够满足液体乳中兽药残留的日常筛查与检测。

3.4 实际样品测定

通过本文建立的QuEChERS EMR-Lipid技术结合LC-QTOF筛查液体乳中兽药残留的方法，对45批次牛奶进行了筛查与确证。

3.4.1 一级谱库检索

按1.3节样品预处理方法进行处理净化，上机测定目标分析物。利用建立的一级谱库，进行134种兽药残留的筛查，发现有一批样品种含有阿奇霉素（Azithro⁃mycin，CAS：83905-01-5，分子式：C38H72N2O12），其理论精确准分子离子质量数为749.5158（[C38H72N2O12]+H）+，实际检测值为749.5152，分子量相差6mu，偏差0.8×10-6，同时还有发现具有明显的（[C38H72N2O12]+NH4）+和（[C38H72N2O12]+Na）+峰，综合检索得分99.03。提取离子色谱图及质谱图见图2。

图2 样品中阿奇霉素的提取离子色谱图及质谱图

3.4.2 二级质谱确证

在Targeted MS/MS采集界面输入阿奇霉素的母离子和保留时间，优化碰撞能量，得到丰富的二级离子，通过MSC解析软件进行结构分析，通过解析可以进一步确定其为阿奇霉素，解析结果见图3。

图3 样品中阿奇霉素的解析结果

3.4.3 以标准物质确证

将1 mg/L标准物质阿奇霉素溶液注入液相色谱四级杆飞行时间质谱仪，采集一级质谱图，与样品进行比对，从比对情况看，样品中的阿奇霉素与标准溶液中的阿奇霉素保留时间一致，准分子离子峰一致。进一步，以阿奇霉素标准物质建立二级谱图，将样品的二级谱图与谱图库中碎片离子谱图进行匹配，见图4。从而可以确定该物质就是阿奇霉素。

图4 样品中阿奇霉素二级谱图比对

4 结 论

本文利用QuEChERS EMR-Lipid技术提取、净化，结合LC-QTOF高分辨的液相色谱-质谱技术，建立了牛奶中兽药的残留的快速筛查与确证方法。本方法快速、简便、灵敏，适用于牛奶中多兽药残留的快速定性确证。

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