植物新品种DUS测试中近似品种的筛选方法

王红娟 林清 蒋晓英 白文钦 官玲 吴红

摘 要 随着新版《种子法》的實施和植物新品种保护权收费的停征，植物新品种权的申请量逐年增长，植物品种特异性、一致性和稳定性（DUS）测试机构的工作量大幅增加。近似品种是特异性判定的基础，快速准确筛选近似品种是DUS测试工作高效有序开展的重要保证。综述DUS测试中筛选近似品种的信息来源和筛选途径，有助于品种测试机构提高DUS测试的效率，缩短植物新品种权的授权周期。DNA分子标记因其诸多优点在近似品种筛选和特异性判定中发挥着重要的作用，最后提出未来DNA分子标记研究的3个方向，为测试机构和育种家开展相关工作提供参考。

关键词 近似品种 ；特异性 ；技术问卷 ；DNA指纹 ；已知品种数据库

中图分类号 S338 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.10.009

Abstract With the implementation of the new edition of "Seed Law" and cessation of new plant variety right fee， the number of applications for new plant variety right has been increasing each year， resulting in substantial increase of the workload of DUS testing station. Similar variety is the base for the examination of distinctness of a variety. Quickly and accurately screening of similar varieties is an important guarantee for the efficient conduction of DUS testing. The data sources and ways of selection of similar varieties in the DUS testing were summarized， which would help the Station to improve efficiency of DUS testing and then shorten the period of authorization of new plant variety rights. The molecular markers are playing an important role in the similar variety selection and distinctness assessment. Three research directions of molecular markers for future research were put forward to give some hints to DUS test stations and breeders in the future work.

Keywords similar variety ； distinctness ； technique questionnaire ； DNA fingerprinting ； database for known varieties

中国于1999年加入国际植物新品种保护联盟（UPOV），履行1978年公约文本[1-2]。在中国，申请品种权的植物新品种应当在中国植物品种保护名录范围内，且应当具备新颖性、特异性、一致性和稳定性，并具有适当的名称[3]。植物新品种特异性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和稳定性（Stability）测试，简称DUS测试。2016年1月1日开始实施的修订版《种子法》规定，DUS测试是申请植物新品种权、主要农作物品种审定和非主要农作物品种登记等品种管理的基本技术依据。随着中国植物育种者品种权意识的不断增强和新品种保护权收费的停征，申请新品种保护的植物种类和品种数量呈逐年增长趋势（图1），仅2016年一年的申请量达2 523件，居UPOV成员第二位；2017年申请量则跃升至3 842件，预计能居UPOV成员首位。同时，申请品种审定和登记也要求出具DUS测试报告。因此，国内DUS测试机构的工作量大幅增加。

特异性审查是DUS测试的关键环节。根据UPOV公约，一个品种明显区别于申请时其他任何已知品种，则认为该品种具有特异性。在实际测试中，把申请品种与所有已知品种进行对比往往不现实。通常的解决方法为从已知品种中筛选出相关形态特征与申请品种最为相似的品种，即近似品种（Similar Varieties），通过种植试验与申请品种相邻种植进行性状比较。近似品种的选择是DUS测试的重要环节，直接影响DUS测试特异性的判定。近似品种选择不合理，往往会导致测试机构的工作量增加，贻误申请审批进程。滕海涛等[4]概述了近似品种的选择依据和方法，有较好的科普意义和指导作用。本文综述筛选近似品种的信息来源和筛选途径，有助于测试机构判定申请品种的特异性，提高DUS测试的效率，缩短新品种权申请的授权周期。

1 筛选近似品种的信息来源

1.1 申请者提供的技术问卷

育种家申请品种保护时需要填写技术问卷，提供申请品种的重要信息（表1）。这些信息对于DUS测试第一个周期的近似品种筛选非常重要。其中起作用最大的是品种的分组性状（Grouping characteristic）。但是，只有当申请者提供的品种信息准确无误，利用这些信息才能筛选到准确的近似品种。事实上，育种家往往更关注和经济价值相关的农艺性状，对一些常见的DUS测试性状如“花青甙显色强度”等性状缺乏观测经验，对表达状态的判断很可能存在较大偏差。那么，要想充分发挥技术问卷信息在近似品种筛选中的重要作用，一方面，需要育种家咨询DUS测试员或者植物学家等相关人员尽可能提供准确的品种描述信息；另一方面，DUS测试员在利用技术问卷信息筛选近似品种时，应能够预见到某些性状的表达状态描述可能不准确，从而设置较大的筛选范围或者排除这些性状，甚至在设计技术问卷性状时避免使用这类性状。

1.2 DUS测试数据

利用技术问卷中有限的信息通常会筛选到较多的近似品种。在完成第一个生长周期的测试后，测试员可以获得申请品种所有测试性状的数据，包括分组性状。利用这些数据，首先可以验证申请人提供的技术问卷信息是否准确；其次可以重新筛选更相近的近似品种，用于第二个测试周期（图2）。同时，申请品种在相同地点相同的试验条件下进行测试，获得的性状数据可比性更强，相互之间也可以比较筛选近似品种。

1.3 DNA数据

随着新一代测序技术的迅速发展，水稻、玉米、小麦等许多作物的基因组、EST或转录组数据相继被释放。利用这些数据可以筛选SSR等分子标记，辅助DUS测试。如李汝玉等基于谷子[5]和大白菜[6]全基因组序列分别开发30对和17对SSR核心引物，这些引物在基因组中分布均匀，多态性好，扩增重复性好，可以用于谷子和大白菜的遗传多样性分析和品种鉴定等领域。SSR分子标记因其诸多优点，是UPOV官方认可的构建DNA指纹数据库的理想标记之一，UPOV制定了相应的技术文件指导其应用[7]。SSR标记在近似品种筛选和品种特异性判定中应用最为广泛[8-15]。如赖运平等[13]利用筛选出的49对SSR引物对80份甘蓝型油菜品种的遗传相似系数进行分析，论证了利用SSR标记筛选近似品种的可行性。张晗等[15]利用21对核心引物和21对扩展引物对36个小麦品种进行扩增，计算两两品种之间的分子距离，当分子距离小于0.2时，判定为近似品种。该方法具有诸多优点，除了标记多态性丰富、不受环境条件影响，还具有检测便捷、重现性好等优点，可以节约DUS测试的时间和经济成本，已成为国内外许多植物近似品种筛选的重要手段。

2 筛选近似品种的途径

2.1 利用已知品种表型性状数据库进行筛选

农业植物品种DUS测试体系已建立统一的自动化办公平台和已知品种表型性状数据库（http：//www.cnpvpdus.cn/DUS/）。测试员可以利用技术问卷中的品种类型和分组性状，以及第一测试周期采集的其他性状进行近似品种筛选（图2）。系统提供了3个供筛选的数据库：已知品种库、测试数据库和技术问卷库，分别对应已经获得授权的申请品种和公知共用的已知品种、安排了测试的申请品种及其近似品种、以及育种家提交申请时技术问卷中填写的性状数据。测试员应当在3个数据库中逐一筛选近似品种，避免遗漏。在第一个测试周期之前，先利用技术问卷中的信息进行初步筛选。其中，品种类型信息用来对品种分组，再利用分组性状在属于相同分组的品种中筛选近似品种。第一个测试周期之后，利用采集的性状信息再次筛选更近似的品种。此外，测试员应根据经验对筛选结果进行分析，保留准确又尽可能少的近似品种。例如，某品种和申请品种在分组性状或者一些重要的农艺性状上表现为近似，则应保留为近似品种。

DUS测试分中心亦可构建所在生态区的已知品种表型性状数据库，如济南分中心自2000年开始对黄淮海地区主要农作物品种进行表型性状数据采集，建立了黄淮海地区大豆[16]、玉米[17]等作物的参照品种数据库，其中包括3 696份玉米品种。受到环境条件、性状类型和观测人员的影响，同一品种同一性状的表达状态代码会发生波动。孙加梅等[17]通过对郑单958等12份品种不同年份性状表达状态代码的波动幅度的研究，将性状分为4个稳定性类别（表2），并据此制定了近似品种筛选时不同性状每个代码的筛选范围，建立了基于表型性状的个性化近似品种筛选方法，取得了较好的效果。

2.2 利用DNA指纹数据库进行筛选

农业农村部已经发布水稻等16种农业植物基于SSR标记的品种鉴定技术规程农业行业标准，并采用标准中的SSR标记，构建了水稻、玉米、小麦、大白菜等作物的DNA指纹数据库，已经具备利用DNA指纹数据筛选近似品种的条件。济南分中心利用小麦已知品种DNA指纹数据库对其2013～2017年测试的小麦品种进行近似品种筛选，把與申请品种间的遗传距离小于0.2（或5个位点）的已知品种作为近似品种，与申请品种一起在田间种植比较。相较于常规利用表型性状的筛选方法，该方法筛选出的近似品种数量减少了约一半，提高了近似品种选择的准确性，缩短了一年的测试周期，降低测试成本。国外的测试机构也将DNA指纹数据用于油菜、辣椒、莴苣、玉米、小麦等作物的近似品种筛选和特异性判定[18-22]。

DUS测试依据的是表型性状，但是植物性状的表达极为复杂，品种间的遗传相似性和表型相似性高度相关但并非是线性关系。也就是说，SSR基因型不同的品种可能表达出相同的表型性状，反过来，SSR基因型相同的品种形态性状可能存在明显差异。因此，通常在第一个测试周期之前利用分子指纹数据筛选近似品种，然后利用第一个测试周期获得的表型性状进行验证，进一步缩小近似品种的范围（图2）。

2.3 排除法

一些品种如玉米杂交种由于育种目标的趋同化等原因，可能筛选到较多的近似品种。第一个测试周期后，利用GAIA法[23]可以排除一部分不近似的品种，以节约第二个测试周期的人力和物力成本（图2）。GAIA法的原理是对第一个测试周期获得的每个有差异的性状进行加权从而计算每对品种之间的表型距离。如果该距离大于“特异性+”（Distinctness Plus）阈值[24]，表明该品种与申请品种有明显差异，不需要在第二个生长期继续种植。“特异性+”阈值的设定对测试员的要求比较高，只有熟悉该作物且DUS测试经验丰富的测试员才能设定合适的阈值。该阈值高于判定特异性所需的阈值水平，以确保达到或者超过该阈值的品种确实有明显差异。

另一方面，育种人提交品种保护申请时，需要提交申请品种的代表性照片。照片提供的信息非常明确，如颜色分布、形状、株形等信息，测试员可以利用这些照片排除明显不近似的品种。该方法对观赏植物近似品种的筛选和排除更为有效，但需要注意照片的拍摄质量及照片对性状反映的真实性问题[25]。DUS测试主管部门已经制定水稻、玉米、花生和甘蓝型油菜等农业植物新品种DUS测试性状照片拍摄规范[26-29]，育种家可以参考拍摄规范进行照片拍摄。

3 展望

目前，表型性状仍是筛选近似品种的主要依据。需要注意的是，受生态环境和不同测试指南版本的影响，在不同地点或者不同生态区测试的品种，以及测试年度跨度较大的品种相比较时，可能筛选出不合适的近似品种，应当谨慎对待。因此，加强已知品种数据库的更新与维护，建立完善的已知品种数据库非常重要。为此，应当长期开展已知品种的信息采集和整理工作，对于数据库中已有但是其性状信息采集时间较为久远的品种，应当重新采集其性状信息，完善和更新数据库。这对各测试分中心筛选合适的近似品种非常重要。

分子标记在DUS测试中的应用越来越广泛，尤其是应用于辅助一致性和特异性判定。利用SSR等分子数据筛选近似品种具有标记丰富、操作便捷、快速准确、不受环境条件影响等诸多优点。未来，分子方法筛选近似品种将成为DUS测试技术发展的必然趋势。以下3个方面应作为重点研究的方向：（1）分子标记的选择。使用的分子标记应随机并均匀分布于植物的基因组中。除了SSR这类以PCR扩增为基础的第二代分子标记，还应开发更多的尤其是以DNA测序为核心的第三代分子标记，如功能基因标记[30]和SNP[31]等。Jamali等[30]引入水稻籽粒长度、淀粉含量、香味和糊化程度的功能基因标记，结果显示除糊化程度外，其余3个功能基因标记能够很容易地将品种划分为不同分组，也能够对品种进行特异性评估。法国品种审定和种子检测中心（GEVES）已将SNP分子标记应用于玉米自交系DUS测试近似品种的筛选和玉米品种库的更新[25]。（2）数据库的构建与完善。构建已知品种的DNA分子数据库应至少设置两组平行试验，取结果相同的数据入库。并验证数据库的质量，保证建成的数据库错误率低于0.5%。（3）篩选阈值的确定。有研究认为，当样品间差异位点数目≤2时，可判定为近似品种[32]。但是，差异位点数目和使用的标记数量有密切关系，笼统地规定≤2个位点显然不合理。张晗等[15]设置的阈值为遗传距离<0.2（或5个位点），对于提高小麦近似品种的筛选效率起到了一定作用。UPOV提出利用传统性状的最小距离校正分子性状的阈值水平。在该模式下，法国测试机构综合利用GAIA表型距离和分子距离，规定表型距离>6，或者表型距离为2-6且分子距离>0.2的品种对判定为具有明显差异（http：//www.upov.int/meetings/en/topic.jsp？group_id=262）。此外，设置阈值时还应当考虑品种的不同类型（自交系、常规种、杂交种、综合品种、群体等）。

值得一提的是，不少国家由申请人提供近似品种，测试机构不再进行筛选。相比测试员，申请人更熟悉申请品种的育种过程及其特征特性，清楚哪些品种与自己的品种更相似。因此，这种做法更加科学。国内的测试机构也要求申请人提供近似品种，陈红[33]详细阐述了申请人填写品种权申请文件时如何选择近似品种并恰当地陈述理由，对申请人有较好的指导意义。但由于申请人或对近似品种的理解不准确，或误当作品种区域试验的对照品种，或抱着侥幸心理，提供的近似品种需要测试员鉴别和确认。因此，仅靠申请人提供近似品种目前并不可行，仍需要测试机构利用表型性状和分子标记筛选近似品种。

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