口蹄疫病毒直接实时荧光RT—qPCR检测方法的建立

吴晓卫+翟建新+杜维+钟文杨+张利

摘要：根据口蹄疫病毒VP1基因保守序列，设计出1对口蹄疫病毒引物FMD-F、FMD-R及特异性探针FMD-Pb序列，建立了一种简便、快速、高效的口蹄疫病的直接实时荧光RT-qPCR（dRT-qPCR）检测方法。结果表明，在特异性方面，对口蹄疫病毒7个血清型的检出率100%；在灵敏度方面，其与常规提取RNA方法对比，阳性检出率差别很小；在对133份未知样本检测方面，dRT-qPCR方法检出阳性88份，常规方法检出阳性84份。dRT-qPCR方法的检测结果更可靠，适于对大量样本进行检测。

关键词：口蹄疫病毒；直接实时荧光RT-qPCR；特异性；诊断检测

中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）06-1165-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.043

Abstract：According to the Foot-and-Mouth disease virus （FMDV） VP1 gene conserved sequence，primers （FMD-F， FMD-R） and specific probe（FMD-Pb） were designed respectively. FMDV was detected fast and conveniently by directly real-time quantitative reverse transcriptase fluorescence PCR（dRT-qPCR）. The results showed that the detection rate of 7 serotype of FMDV by dRT-qPCR was 100%. Moreover， there wasnt significantly difference between dRT-qPCR and conventional method. In the unknown-sample-detection， by dRT-qPCR method， 88 positive samples could be detected in the 133 unknown samples， while only 84 positive samples were detected by conventional method. dRT-qPCR method， with rapid， accurate， specific and sensitive advantage， can be used for the diagnosis detection and real-time monitoring of FMDV.

Key words：Foot-and-Mouth disease virus； directly real-time quantitative reverse transcriptase fluorescence PCR（dRT-qPCR）； specificity； diagnosis detection

口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV）是口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）的病源体，能够感染猪、牛、羊等偶蹄兽引起急性、烈性、接触性传染病[1]。研究表明，感染口蹄疫病毒的牲畜常呈现进食量下降，机体抵抗力和免疫力降低，并容易继发其他病毒性疾病和细菌性疾病，从而造成受感染动物的生产性能下降，危害畜牧业正常生产和发展[2]。世界动物卫生组织（OIE）将口蹄疫列为必须报告的动物传染病，中国将其归为一类动物疫病[3]。

FMDV共有7个血清型，即C型、A型、O型、 Asia Ⅰ型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型和SAT Ⅲ型，每个血清型又有许多不同的亚型，且各血清型之间没有交叉性免疫，同一血清型的各亚型之间仅有部分交叉免疫，使得口蹄疫的诊断和控制更加困难[4]。目前，口蹄疫病毒感染的特异性诊断技术包括病原学、免疫学、分子生物学等6种方法[5]，即病毒分离法、血清学检测技术、免疫荧光法、酶联免疫吸附（ELISA）以及反转录聚合酶链式反应（Quantitative reverse transcriptase PCR，RT-qPCR）和基因芯片技术。病毒的分离培养、血清学检测、免疫荧光法、酶联免疫吸附（ELISA）法存在耗时长、阳性检出率低、敏感性较差、不易标准化等缺点[6]，在实际应用中具有一定的局限性，无法满足大量样本的快速诊断。反转录聚合酶链（RT-qPCR）的检测技术需要提取病毒RNA，再进行qPCR扩增和后续产物处理，在处理痕量样本上，提取病毒RNA过程容易发生RNA降解或交叉污染等事件，仍存在较大困难，无法高通量、低成本、高效率地快速检测[7]。基因芯片技术对引物探针设计要求非常高，成本消耗大、结果假陽性率偏高、重复性差等缺陷，并且现有的基因芯片技术不及其他检测技术[8]。

本研究采用直接扩增反转录聚合酶链（directly Quantitative reverse transcrip-tase PCR，dRT-qPCR）的检测技术，直接将样本加入反应管内进行检测，达到快速、准确检测口蹄疫病毒的目的，同时可以节省成本和降低交叉污染的风险。

1 材料与方法

1.1 试验材料

口蹄疫A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7个血清型的病毒株，均为灭活的细胞培养毒，-80 ℃冰箱保存备用。待测牛血清样品44份、牛疱疹液样品28份、猪血清样品22份、猪疱疹液样品19份共计113份田间样品，-80 ℃冰箱保存。所有材料均为深圳市某卫生监督所赠送的口蹄疫样品，样品保存于澳东检验检测科技有限公司研发实验室-80 ℃冰箱。

1.2 引物探针设计

参考GenBank数据库中的4 000余条口蹄疫病毒的VP1基因序列，选择口蹄疫病毒VP1基因序列作为检测的扩增区域。使用NCBI网站上的BLAST工具、DNAStar、PrimerExpress等软件以及自行设计编写的分析软件设计特异性的引物和探针序列，分析引物之间的相互作用，优化和筛选引物探针组合，最大限度减少反应中二聚体的产生，以保证试剂的高特异性、高灵敏度和高基因型覆盖率。

设计的引物探针包括上游引物FMD-F、下游引物FMD-R、探针FMD-Pb。其中探针FMD-Pb 5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团。设计的引物探针交由上海基康生物技术有限公司合成，序列如表1所示。

1.3 样本处理

采用直接扩增技术，不需要对核酸样本进行提取纯化。取一定量血清样本加入3倍体积的甲醇，混匀后静置5 min，于3 000 r/min离心15 min，取上清液备用；水疱疹液样本，直接将采集的水疱疹液，于6 000 r/min离心10 min，取上清液备用。

1.4 扩增反应条件优化

根據最优反应体系组分的反应管放入荧光定量PCR仪中，对扩增反应条件进行探索。

1）病毒RNA释放及反转录温度（50～60 ℃），10～30 min。

2）预变性温度（90～95 ℃），5～20 min。

3）变性温度（90～95 ℃），5～20 s。

4）退火/延伸温度（60～65 ℃）、退火/延伸时间（30～120 s）、qPCR循环数（35～45）。

1.5 dRT-qPCR特异性试验

应用dRT-qPCR检测方法对口蹄疫病毒A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7个亚型的核酸样本和以DEPC水为样本的阴性对照，进行检测以观察特异性结果。

1.6 dRT-qPCR分析灵敏度试验

应用dRT-qPCR试剂盒（不提纯样本）和某公司产的试剂盒（提纯样本）对口蹄疫病毒A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7个血清型的核酸样本稀释至10 pg/μL的核酸浓度各40份进行RT-qPCR扩增检测，观察分析灵敏度结果。

1.7 dRT-qPCR样品检测试验

分别采用dRT-qPCR检测方法和常规方法对深圳市光明新区疾病预防控制中心保存的113份口蹄疫样本进行检测，以已知的A型核酸样本作为阳性对照，DEPC水为样本作为阴性对照。

1.8 结果判定

FAM通道均无扩增曲线结果判定为阴性；FAM通道Ct值≤35.0，且出现明显的指数增长期，表示样本为阳性；病毒检测结果的Ct值在35.0

2 结果与分析

2.1 试剂盒组分确定

经过摸索，确定了dRT-qPCR的反应体系试剂盒。总反应体系为25 μL，主要包含：12 μL 2×Buffer Mix，2 μL dRT-qPCR 酶混液（Taq酶0.5 μL，M-MLV酶0.4 μL，酶保存液1.1 μL），0.8 μmol/L口蹄疫病毒引物探针混合液（FMD-F∶FMD-R∶FMD-Pb=3∶3∶2），0.4 μmol/L dNTPs，RNA酶抑制剂10 U，5 μL检测样本，DEPC水补足至25 μL。

2.2 最优反应条件确定

确定了最优扩增反应条件，见表2。荧光信号收集设定在40循环的退火/延伸时。

2.3 dRT-qPCR扩增特异性结果

口蹄疫病毒A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7个血清型的核酸样本和以DEPC水为样本的阴性对照，25 μL反应体系和45循环（5循环+40循环）反应程序，扩增时间105 min，特异性检测结果如图1（阈值30 000）所示。从图1可以看出，口蹄疫病毒7个亚型的核酸样本都有扩增曲线，阴性对照为水平线，表明用dRT-qPCR方法能够检测出口蹄疫病毒7个血清型的核酸样本，且特异性良好。

2.4 dRT-qPCR分析灵敏度结果

口蹄疫病毒A型、O型、Asia Ⅰ型、C型、SAT Ⅰ型、SAT Ⅱ型、SAT Ⅲ型7个血清型的核酸样本稀释至10 pg/μL的核酸浓度40份，用dRT-qPCR试剂盒和某公司试剂盒进行扩增检测，结果如表3所示。从表3可知，dRT-qPCR试剂盒和某公司试剂盒对口蹄疫病毒进行扩增检测。结果表明，这两种方法所检测出的阳性样本数差别很小，说明它们具有相一致的分析灵敏度。

2.5 样本检测结果

对113份口蹄疫样本进行检测，得到检测结果如表4、表5所示。从表4、表5中可以看出，dRT-qPCR检测出的阳性样本数88份，常规方法检测出阳性样本数84份，常规方法有可能出现漏检情况或出现结果随机性。结果表明，dRT-qPCR检测方法对于样本检测可行。

3 小结与讨论

口蹄疫病毒有7个血清型，且每个血清型又有多个不同的亚型，使对口蹄疫病毒的快速检测非常困难。现有的病毒分离法、流行病学分析、蛋白质组学相关的免疫技术和ELISA等方法在检测过程仍有部分缺陷[9]，目前使用较多的方法是核酸检测技术，能直观地反映病毒感染情况[10]，常用于检测口蹄疫病毒检测。核酸检测技术主要通过RT-qPCR或qPCR方法进行，常规RT-qPCR或qPCR方法所检测的样本都需要经过提取纯化，但某些特殊样本会携带有肝素、血红蛋白、铁血红蛋白等反转录酶抑制成分[11]，往往对结果造成影响；而对于某些低浓度的样本，可能在纯化后提取的样本量非常少，容易造成阳性漏检现象，这将对口蹄疫爆发时期很不利，无法进行实施监控[12-14]。

本研究建立的dRT-qPCR方法可以用来检测病毒核酸样本，且样本检出时间为1.5 h，常规检测需要8 h[15]，dRT-qPCR方法大大缩短了检测时间，提高了检测效率，且具有快速、准确、特异、敏感的优点，为监测口蹄疫疫情以及国内各出入境与口岸机关对于口蹄疫病毒检疫检验提供了一种非常方便的技术手段。

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