miRNAs在植物色泽调控中的研究进展

王荣+魏梦苒+赵大球

摘要：色泽是影响植物外观品质及其商品价值的重要因素，目前关于植物色泽的研究主要集中于生理生化及转录水平上，而在转录后水平上报道较少。microRNA（miRNA）是一类在真核生物中广泛存在的非编码单链RNA分子，它可以通过对靶标mRNA的互补配对而降解或抑制mRNA的翻译，从而在转录后水平上对基因的表达进行负调控。简述了miRNA的作用机理，并对近几年miRNA在植物色泽调控中的研究进展进行了综述，以期为植物色泽在转录后水平上的调控奠定基础。

关键词：色泽；miRNA；花青素；类胡萝卜素

中图分类号：Q943.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）06-1001-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.001

Abstract： Color is an important factor that influences the appearance quality of plants and their commodity value. Current studies on plant color are mainly focused on the physiological， biochemical and transcription level， while the post-transcriptional level is rarely reported. MicroRNAs （miRNAs） are short regulatory non-coding RNAs that guide gene silencing in most eukaryotes. They regulate gene expression by triggering sequence-specific cleavage or translational repression of target transcripts. This review briefly describes the mechanism of miRNA， and summarizes the advances on miRNAs in plant colors regulation， which would lay the foundation for the regulation of plant color in the post-transcriptional level.

Key words： color； miRNA； anthocyanin； carotenoid

色泽对于植物而言至关重要，它不但影响植株的外观品质，而且直接关系到其商品价值[1]。植物色泽是由多种因素共同作用形成的，其中色素的种类及其含量最为重要[2]，主要包括叶绿素、类黄酮、类胡萝卜素和生物碱等四大类物质[3]。在这些物质中，类黄酮是最重要的色素类群，产生的颜色范围最广，可以从浅黄色到蓝紫色，是众多观赏植物的主要呈色色素。作为类黄酮色素群的主要种类，花青素在植物色泽形成中起着不可替代的作用，其呈色范围很广，并且相较于其他色素而言研究得较为透彻[4]。

目前，对于植物色泽的研究主要集中在转录水平上。以调控花青素来影响植物色泽为例[5，6]，通过相关研究目前已经明确植物花青素的生物合成途径，主要受到结构基因和调节基因共同调控[7]。其中，结构基因直接通过编码相关酶来调控花青素的合成，而调节基因是通过转录因子（MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40蛋白[8]）调节结构基因的表达来影响色泽[9]。关于这方面的研究进展在很多综述中均已被提及[10，11]。随着现代分子生物学技术的快速发展，人们发现在转录后水平上microRNA（miRNA）对植物色泽形成具有不可替代的调控作用[12]，尤其是在花青素的生物合成方面，它通过负调控与花青素合成有关的转录因子等的转录或翻译，抑制靶基因的表达，进而调控植物色泽[13]。目前，关于miRNA在植物色泽调控方面的研究进展一直未见报道，为此，本研究拟以花青素为突破口，对miRNA调控植物色泽的相关研究进行综述，以期为植物色泽在转录后水平上的调控奠定基础。

1 miRNA的作用机理

miRNA是生物体内长度为21或22个核苷酸的非编码单链RNA，其主要和转录因子通过相互协作来调节下游目标基因的表达[14]，在调节基因表达转录后水平和植物开发中起着重要的作用[15]。目前miRNA在许多生物过程都发挥着重要作用，特别是在癌症诊断和治疗方面，被人们认为是潜在的目标和生物标志物[16]。而与人体、动物相比，植物miRNA研究相对较少，主要集中于拟南芥、水稻等已经完成全基因组测序的模式植物上[17]，而研究方向也多集中于植物抗逆方面[18，19]。与动物有所不同，植物miRNA与靶位点的匹配程度更高，因此不仅可以通过阻止核糖体在mRNA上移动来抑制基因表达，还可以通过对mRNA进行降解、阻止mRNA的翻译来调控基因的表达。研究表明，一个miRNA可以调控上百个靶基因[20-23]，并且已知的植物miRNA显示了很强的靶向转录因子家族成员或其他控制发育基因的偏性[24-26]，其在植物生長发育、生殖分化和抵抗逆境胁迫中都发挥着显著作用。此外，miRNA的表达还存在着基因型和组织部位的差异性[27]，不同的miRNA在植物根[28，29]、茎叶[30-35]、花发育[36-39]以及器官极性与分化[40-43]中的作用并不一致。

2 miRNA对花青素合成的调控

研究表明，miRNA对于植物色泽具有一定的调控作用，并且相关研究主要集中于花青素生物合成调控，目前已报道的miRNA家族有miR156、miR828、miR858、miR165/166和miR778，并且不同家族对花青素生物合成的调控机制各异[23，44-48]。miR156通过靶向SPL转录因子对花青素的生物合成起着负调控作用[44]；miR828通过介导调控靶基因TAS4，在缺磷条件下对PAP1/MYB75、PAP2/MYB90和MYB113的表达进行调控，进而影响花青素的积累[45]；miR858通过靶向MYB12参与花青素合成的调控[46]；miR165/166对花青素的合成具有负向调控的作用[47]；过量表达的miR778在缺磷条件下会促进花青素的积累[48]。下面着重对这几类miRNA家族进行重点综述，以利于今后对植物色泽的研究。

2.1 miR156

miR156长度为20个核苷酸，最早在拟南芥中被发现[23]，它被认定为是最保守的miRNA，在单子叶植物、双子叶植物、蕨类植物和苔藓植物中均存在[49]。miR156的靶基因为SPL转录因子[50]，在拟南芥中共发现17个SPL转录因子成员，其中11个是miR156的靶基因[51，52]。Gou等[44]研究发现在拟南芥中miR156的靶向基因SPL9负向调控花青素的合成，SPL9与PAP1蛋白相互作用，进而影响MYB-bHLH-WD40复合体的转录激活活性，从而抑制了花青素生物合成基因ANS和DFR等的表达[53]。Yan等[54]研究发现miR156通过靶向SPL9转录因子对MYB基因进行负调控，从而阻止了花青素的积累。此外，Franco-Zorrilla等[55]和Gou等[44]分别通过构建miR156过量表达载体和沉默表达载体转化拟南芥植株来研究miR156在花青素合成中的功能。结果显示，过量表达植株的花青素含量提高了4倍，而沉默表达植株的花青素含量仅为对照的1/10，这充分表明miR156可以通过调控花青素含量的积累来影响植物色泽。

2.2 miR828

外芥糖诱导花青素合成异常的突变体的 miR828是最初通过深度测序在拟南芥中发现的新miRNA[56，57]，目前在杨树、大戟科植物中都有发现[58]。目前有关miR828生物学功能方面的研究虽然刚刚起步，但miR828在调控植物花青素合成方面的功能已经明确。在拟南芥中，miR828介导调控的靶基因TAS4与花青素合成有关，miR828能够诱发TAS4转录本的剪切，进而调控下游靶基因所编码的MYB转录因子以调控花青素的合成[57，59]。Yang等[60]研究发现野生拟南芥植株中花青素含量比miR828转基因植物高2.5倍，这表明miR828抑制体内花青素的合成。谢烨等[61]发现miR828过表达拟南芥植株中蔗糖诱导的花青素积累比野生型少，其作用效果与miR828的靶基因TAS4导致花青素积累量高的结果一致，miR828负调控花青素合成。Luo等[62]通过蔗糖诱导花青素合成表型，建立了一种筛选拟南芥糖诱导花青素合成异常突变体的方法，从T-DNA插入突变体库中筛选出一个新的miR828功能缺失的突变体，并通过构建miR828过表达株系证明miR828能够在蔗糖诱导下负调控花青素的合成。此外，贾小云等[63]从模式植物拟南芥中分离到pri-miR828基因，在番茄植株过表达导致其靶基因myb-like1转录因子表达量和花青素含量降低，表明miR828可能通过类似的机制参与拟南芥和番茄植株体内花青素合成途径的调控。

2.3 miR858

miR858也是近来发现生物功能还未完全探究的miRNA[64]，同时在番茄、葡萄和拟南芥中均获得了其靶基因MYB12，而MYB12对花青素的合成具有重要调控作用[65-67]。在番茄中，Ballester等[68]通过病毒介导的MYB12基因沉默使果实变为粉红色，结果显示在果皮中的MYB12表达量与所有类黄酮物质的表达量均相关。在葡萄中，Matus等[69]发现MYB12基因表达量的下降直接导致黄酮醇含量的减少。而在拟南芥中，Mehrtens等[67]使用高效液相色谱法比较分析了MYB12过量表达植株和MYB12缺失表达植株，发现MYB12过量表达植株中类黄酮物质含量较高，而MYB12功能缺失突变体的植株中类黄酮物质含量较少，通过进一步的研究表明，MYB12是调控CHS和FLS的转录调控因子，而这两个基因对黄酮醇合成起着不可或缺的作用，由此可以推测，miR858可以通过调控黄酮醇的合成来影响花青素的含量，进而影响色泽。此外，沈洁[64]对T1代miR858减低表达转基因番茄植株进行了研究，结果显示，miR858较对照野生型下调表达的同时，其靶基因MYB12和Sly-myb-like上调表达，与花青素合成有关的酶基因也均上调表达，花青素含量增加。

2.4 miR165/166

与miR828家族类似，miR165/166也是通过其靶基因调控花青素代谢中的关键酶基因来影响花青素的合成。而目前研究miR165/166家族对花青素的调控作用主要是利用STTM（Short tandem target mimic）技术构建miRNA功能缺失突变体来进行。这种技术是在TM（Target mimic）技术的基础上，将miRNA sponge和同源性竞争RNA相结合创立的一种新技术，其能够有效抑制miRNA活性，使miRNA的沉默效率达到95%以上[70]。Tang等[47]通过STTM技术沉默了拟南芥叶片内源的miR165/166，发现与花青素生物合成有关的一些基因大量表达，从而引起植株体内的花青素含量显著增加，色泽发生改变。这表明miR165/166基因主要是通过负向调控花青素的生物合成来影响植物色泽。

2.5 miR778

miR778同样是在拟南芥中通过高通量测序被确定的[71，72]，Hsieh等[45]利用小RNA深度测序的方法研究发现在拟南芥中miR778在低磷胁迫下上调表达。此外，Wang等[48]发现在缺磷条件下，miR778不仅能够适度增强主根和侧根的生长，还能促进花青素的积累，转miR778拟南芥植株中积累的花青素含量比野生型株高1.9倍，相反地，构建使miR778沉默表达的MIM778转基因拟南芥植株积累的花青素含量与野生型植株并无差别，这也证明了在磷不足的条件下，过量表达的miR778能够促进花青素的积累。

3 miRNA对其他色素合成的调控

与调控花青素的合成相比，miRNA在调控其他色素合成上的研究较少。Xu等[73]通过使用Illumina公司测序方法来识别和定量红色果肉甜橙突变体及其野生型miRNA，发现51个与甜橙转录调控、蛋白质修饰和光合作用相关的miRNA显著调节番茄红素等类胡萝卜素含量，其中miR1857的差異表达可能是引起突变体中番茄红素的异常积累，从而改变了果肉的颜色。此外，He等[74]发现拟南芥在低氮环境条件下，miR826和miR5090高表达植株生长更快，能够积累更多的叶绿素。

4 展望

色澤作为植物的一个重要性状，目前关于其形成机理研究在生理生化和转录水平上已经较为透彻，而在转录后水平上探知较少。随着现代基因工程技术的快速发展，利用miRNA调控植物色泽已成为一个研究热点。经过研究者的不懈努力，在miRNA调控植物色泽上虽然取得了一定的成果，但这些研究主要集中于拟南芥等模式植物上，而针对观赏植物开展的研究并不多见，因此miRNA调控观赏植物色泽方面的研究还有待加强。与此同时，随着miRNA在植物上的研究越来越多，很多问题也接踵而至。例如，miRNA与靶基因两者之间并不是完全互补匹配，因此对预测的靶基因需要开展一系列的验证工作。此外，虽然植物miRNA相比动物而言更具保守性，但不同植物中存在大量自身特异的miRNA，这些miRNA急待被发现，而这都将依赖于日后更为深入的研究。

综上所述，利用miRNA调控植物色泽的研究方兴未艾，层出不穷的新方法、新手段将为今后深入研究提供可靠的技术支撑。前人在模式植物上开展的miRNA调控色泽研究为今后在观赏植物上的研究提供了大量参考。相信在不久的将来，利用miRNA技术在转录后水平上定向地改造植物的色泽、甚至创造出自然界中不存在的珍稀色泽品种都将成为可能。

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