无NH4NO3培养基SK设计及其组培效果

梁秋玲 张能 全国龙 黄庆锋

摘 要 无NH4NO3条件下，参考MS及ER大量元素离子浓度，设计SK大量元素组分，SK铁盐、微量元素及有机物同MS，得到SK基本培养基。以‘广林9号巨尾桉、黑金刚橡胶榕、美酒白掌为试材，评价其组培效果。结果表明：SK适用于‘广林9号巨尾桉增殖及所有参试物种生根培养；SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g适用于黑金刚橡胶榕和美酒白掌增殖培养。

关键词 NH4NO3 ；组织培养 ；SK ；MS

中图分类号 Q943 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.10.004

Abstract Consulting the ion concentration of macro elements in the MS and ER， the macro element constituents of the cultural medium SK without NH4NO3 were designed. The basal SK medium prepared was similar to the MS in molysite， microelements and organic matters. The prepared SK was used to culture the explants of Eucalyptus hybrid Guanglin 9 （Eucalyptus grandis×E. urophylla）， Ficus elastic ‘Decora Burgundyand Spathiphyllum mojo to evaluate its effect on tissue culture. The results showed that the SK was suitable for the rooting of Eucalyptus hybrid Guanglin 9 and other materials. The SK+Cuiyun （18-18-18） water-soluble fertilizer was suitable for the proliferation of F. elastic‘Decora Burgundyand S. mojo.

Keywords NH4NO3 ； tissue culture ； SK ； MS

MS培養基由Murashige 和 Skoog于1962年发布，其普遍适用性及稳定性使其广泛用于多种植物的各类组织培养。香蕉[1]、兰花[2-4]及桉树[5]等实现工业化组培育苗的品种，其培养基均由MS衍生改良而来。硝酸铵NH4NO3为MS主要构成成分，占大量元素质量百分比36.4%，是MS铵态氮NH4+的来源，同时维持了NH4+与NO3-摩尔浓度近似1∶2的合适比例。NH4NO3是《危险化学品安全管理条例》及《民用爆炸物品安全管理条例》管制药剂，禁止纯品NH4NO3市场流通，NH4NO3的禁用对组培产业可谓釜底抽薪，寻求NH4NO3有效替代品维持正常生产成为产业生存与发展的重要课题。

王媛花[6]将MS培养基NH4NO3替换为3.4 g/L （NH4）2SO4，对苹果、草莓和葡萄组培苗进行试验，报道结论为继代的植物叶片平展，叶色嫩绿，植物幼嫩组织含水量高，植株生长旺盛。大量元素的简单替换导致离子浓度大幅波动，其NH4+及SO42-水平远远超过MS、ER、B5、WPM等常用培养基，NH4+与NO3-比例亦是独树一帜达到2.74∶1，而据普遍适用的规律，培养基内过高NH4+水平，持续培养会抑制培养物生长，诱发玻璃化等毒害反应，该配方应用效果和适应性有待验证。

本研究使用（NH4）2SO4、（NH4）3PO4和NH4Cl提供NH4+，Ca（NO3）2、Mg（NO3）2和KNO3提供NO3-，部分替换NH4NO3，重新设计培养基，使其大量元素离子浓度与MS、ER等常用培养基接近，能维持组培苗正常生长，应对NH4NO3短缺对组培产业带来的挑战，需求迫切，具备现实的生产意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药剂

用于配制大量元素、铁盐、微量元素及有机物的药剂均为广州化学试剂厂生产的分析纯试剂，蔗糖为食用级白砂糖，卡拉胶为北京康倍斯科技有限公司生产。翠筠（18-18-18）水溶肥由佛山市顺德区翠筠园艺有限公司生产，其标识成分为：全氮18%（其中铵态氮3.6%、硝态氮5.3%）、水溶性磷18%、水溶性钾18%、水溶氧化镁2%。

1.1.2 培养材料

‘广林9号巨尾桉、黑金刚橡胶榕、美酒白掌组培苗均为湛江市森科种苗有限公司生产用继代材料，无细菌污染。

1.2 方法

1.2.1 参试材料组培方法

原始培养基：（1）‘广林9号巨尾桉，增殖ER+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L，生根1/2 ER+NAA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L；（2）黑金刚橡胶榕，增殖MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，生根MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L；（3）美酒白掌，增殖MS+6-BA 1.5 mg/L，生根MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L。所有培养基均加入卡拉胶6.5 g/L、白砂糖30 g/L，灭菌前pH调节为5.8。

培养环境：培养室光照强度1 600 lx、培养温度（26±2）℃；炼苗间为单层遮阳网大棚，遮光率40%，配备风机水帘。

培养周期：‘广林9号巨尾桉继代增殖周期20 d，生根培养时间为25 d；黑金刚橡胶榕继代增殖周期30 d，生根培养时间为25 d；美酒白掌继代增殖周期30 d，生根培养时间为35 d。

生根苗接入标准：‘广林9号巨尾丛生芽内高度>1.0 cm单芽可用于生根，切取长度0.5 cm顶芽接种至生根培养基；黑金刚橡胶榕高度>2.0 cm单芽可用于生根，切取长度1.2～1.5 cm顶芽接种至生根培养基；美酒白掌高度>2.5 cm单芽可用于生根，将单芽完整的从丛生芽分离，接种至生根培养基。达不到高度要求但形态完整的单芽保留在接种团块上用于继代，本研究将可用于生根的单芽称为生根芽、形态完整的后备单芽称为后备芽。

1.2.2 SK配方

SK大量元素组成，Ca（NO3）2 494 mg/L，Mg（NO3）2 222 mg/L，（NH4）2SO4 198 mg/L，（NH4）3PO4 372 mg/L，NH4Cl 321 mg/L， KNO3 2 153 mg/L；SK微量元素、铁盐、有机物同MS。

1.2.3 SK适应性测试

‘广林9号巨尾桉增殖、黑金刚橡胶榕、美酒白掌组培苗增殖和生根培养均设置MS、ER、SK、SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g基本培养基共4个处理，‘广林9号巨尾桉原基本培养基为1/2 ER，则基本培养基处理大量元素均减半。各物种原有培养基激素、培养环境和培养周期等保持不变。

（1） 各培养基对参试材料增殖继代的影响

以生产用继代增殖材料，接入试验培养基，每个处理重复3次，每个重复接种30瓶，继代周期完成后，选择具备代表性的增殖材料重新转入相同试验培养基进行第2代培养，共培养3代。第3代继代培养周期完成后观察其增殖苗植株形态是否出现可见变化，玻璃化程度、小芽完整程度、叶片是否正常展开。统计单瓶增殖苗内生根芽及后备芽数量，测量生根芽基部茎粗及高度等指标。

（2） 各培养基对參试材料生根培养的影响

‘广林9号巨尾桉使用1.2.3（1）所得SK增殖试验苗、黑金刚橡胶榕及美酒白掌使用SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g增殖试验苗作为试材，接入不同生根培养基，使用生产配方接种生根苗作为对照。每个处理重复3次，每个重复接种30瓶，接种10 d，剔除污染，带瓶转移至炼苗棚炼苗，各品种生根培养时间结束后，观测生根苗顶芽生长是否正常，根系完整情况及根系质地，测量生根苗高度、根系条数并分析。

2 结果与分析

2.1 SK与MS、ER大量元素离子浓度比较

SK、MS及ER大量元素离子浓度见表1。

由表1可知：SK大量元素离子Ca22+、Mg2+、SO42-、Cl-均与MS及ER相同。SK铵态氮NH4+离子浓度为16.50 mmol/L，介于MS和ER之间，SK硝态氮NO3-离子浓度为30.28 mmol/L，低于MS和ER。SK钾离子K+浓度为21.30 mmol/L ，与ER相同，略高于MS。SK磷酸根PO42-浓度为2.50 mmol/L，与ER相同，为MS磷酸根PO42-浓度的2倍。SK总氮素为46.78 mmol/L，SK、MS、ER总氮素比为0.78∶1∶0.81，各培养基NO3-/ NH4+比例均接近2∶1。

SK大量元素组成未使用NH4NO3，由（NH4）2SO4、（NH4）3PO4和NH4Cl提供NH4+， Ga（NO3）2、Mg（NO3）2和KNO3提供NO3-，部分替代了NH4NO3功能，SK大量元素离子浓度除NO3-、NH4+以外，均与MS、ER接近，总氮素与ER接近，且NO3-/NH4+比接近2∶1，符合一般富盐培养基的设计规律。

2.2 SK 适应性测试

2.2.1 基本培养基处理对各参试物种增殖继代培养的影响

基本培养基处理对‘广林9号巨尾桉、黑金刚橡胶榕及美酒白掌组培苗增殖均存在影响。（1）‘广林9号巨尾桉，MS及SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g基本培养基处理，增殖苗生长旺盛，组织含水量高，呈现轻微玻璃化，丛生芽多而叶片大，丛生芽内单芽茎干纤细。ER和SK基本培养基处理，苗木形态正常，充实健壮，且丛生芽内单芽质地趋向木质化，利于生根培养。（2）黑金刚橡胶榕，MS及SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g基本培养基处理，丛生芽团块基部轻微愈伤化，增殖苗生长旺盛，丛生芽内单芽茎干粗壮整齐、未见玻璃化、顶芽色泽和形态均正常。ER和SK基本培养基处理，丛生芽团块愈伤极少，苗木形态正常，丛生芽内单芽茎粗不均匀，部分单芽较纤细、顶芽叶片小，不能正常用于生根培养。（3）美酒白掌，MS及SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g基本培养基处理，丛生芽团块少量不定根发生，增殖苗生长旺盛，丛生芽内单芽叶柄粗壮，叶片正常展开、叶色浓绿未见玻璃化，可生根单芽矮缩茎膨大。ER和SK基本培养基处理，丛生芽团块不定根发生较多，增殖苗长势稍差，部分单芽细弱、叶片窄而狭长、叶色淡绿，可生根单芽矮缩茎未见明显膨大。相关指标见表2。

由表2可知，（1）对‘广林9号巨尾桉，MS处理效果与SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g处理效果类似，呈现后备芽多而生根芽少、生根芽纤细而高生长明显的趋势。ER和SK培养基效果类似，有效生根芽数量多，而后备芽也能正常发育为有效生根芽，生根芽粗壮敦实。（2）对黑金刚橡胶榕增殖苗的影响，各处理后备芽数量、生根芽高度不存在统计学差异。效果类似，有效生根芽数量多，单芽茎基直径大，与ER和SK处理差异显著，MS处理与SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g处理之间在有效生根芽数量和单芽茎基直径上不存在统计学差异，ER和SK处理之间亦不存在统计学差异。（3）对美酒白掌的影响，各基本培养基处理后备芽数量不存在统计学差异，ER和SK处理继代过程中后备芽不能正常发育达到生根标准，其生根芽数量和生根芽茎基直径均显著小于MS与SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g处理。

2.2.2 基本培养基处理对各参试物种生根培养的影响

各基本培养基处理均能使各参试组培苗100%生根，且苗木生长健壮，顶芽色泽及形态均正常，根系完整，主根生长均匀且木质化程度良好、侧根发达，根冠比例正常。各处理相关指标见表3。

由表3可知，各基本培养基处理对‘广林9号巨尾桉、黑金刚橡胶榕和美酒白掌生根苗高度、生根苗茎基直径的影响均不构成统计学差异。低盐培养基ER和SK，生根条数优于MS与SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g处理。

3 结论与讨论

SK大量元素离子浓度设计合理，NO3-/NH4+比接近2∶1，符合一般富盐培养基的设计规律。在培养基适应性研究过程中发现，SK或SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g培养基，可使参试物种正常增殖继代和生根培养，SK应用效果和ER接近，SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g应用效果同MS接近。MS为组培常用培养基，ER亦为经典培养基，但二者均需用到NH4NO3，SK用其它药品完全取代了NH4NO3，为应对NH4NO3禁用对组培产业的影响提供了简单可行的解决方案。

诸葛强[7]使用将大量元素调整为NH4NO3 850 mg/L、KNO3 2 000 mg/L、KH2PO3 100 mg/L的改良MS培养基，对杉木、北美红杉组培效果良好，扩大试验至20余种木本植物，其改良MS培养基适应性广泛，认为降低MS硝酸铵NH4NO3用量，对木本植物组织培养更为适宜。与本研究‘广林9号巨尾桉组织培养中低NH4NO3培养基ER观察结果类似。将SK培养基中2.5 mmol/L （NH4）3PO3替换为1.25 mmol/L NH4H2PO3，其大量元素离子浓度与诸葛强改良MS接近相同，为在SK基础上配方的改良，提供了思路。

郎贤波[8]将MS氮素总量降为 30、NO3-/NH4+比接近2∶1时，可促进马铃薯试管苗地上部和地下部的生长；磷浓度提高为2.5 mmol/L 时，有利于马铃薯的增殖和地上部生长，磷浓度为1.25 mmol/L时，根的生长旺盛。SK相比于MS，其离子浓度变化趋势和郎贤波对MS的改良相同，蔡茁[8]对人参组培中MS无机元素消耗率经计算 N 为 27.16%、K 为 8.39%、P 为 78.17%，也在一定程度上反应了MS降低总氮素浓度，提高磷浓度的可行性。

SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g设计，在一定程度上补偿了SK总氮素的不足，试验中其对黑金刚橡胶榕和美酒白掌增殖表现良好，效果与MS类似。翠筠（18-18-18）水溶肥中9.1%的酰胺态氮以及磷、钾、镁的加入，未对参试植物产生可见伤害。

本研究SK生根培养适应性研究发现，参试生根苗，根系条数虽然出现了统计学差异，但苗木状态与质量均符合生产需要。分析其原因，所参试培养基养分接近，而组培苗养分吸收、利用到产生质量变化也是一个相对缓慢的过程，即量变积累不足以引发质变。

参考文献

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