环状核糖核酸的生物功能及其在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的研究进展

毕莲茹、王宝、罗南、侯秀伟、陈庆宇、廉瑞、赵洋综述，宋春莉审校

环状RNA（Circular RNA，circRNA）是一类特殊的非编码内源性RNA（Nocoding RNA，ncRNA），具有闭合环状结构且大量存在于真核转录组中的非编码RNA。circRNA具有很强的组织特异性，且越来越多的研究表明circRNA在转录、转录后及翻译过程中均发挥着重要的作用[1]。早在20世纪70年代，Sanger等[2]就在植物类RNA病毒中发现了circRNA，但由于当时科技水平的限制，仅把其当作基因转录过程中发生错误剪接形成的产物而未给予重视[3]。直到近几年来随着生物信息学的快速发展和高通量测序技术的不断革新，circRNA的数量和部分功能才被学者们不断发现。环状RNA是一类闭合环状RNA分子，由于无 5' 端帽子结构及 3' 端 ，也无多聚A 尾，不受 RNA外切酶的降解，因此可以稳定且广泛地存在于生物界，具有进化保守性[4]。环状RNA按照来源主要分为外显子环状RNA（exon circRNA，ecircRNA）[5]、内含子环状 RNA（intron circRNA，ciRNA）[6]、外显子内含子环状RNA（exon-intron circRNA，EIciRNA）[7]三类。本文主要介绍环状RNA的生物功能及其在冠状动脉粥样硬化性心脏病中研究进展。

1 环状RNA的形成机制及其生物学功能

1.1 环状RNA的形成机制

目前环状RNA形成的机制主要有三种形式[8]：（1）内含子配对驱动环化（intron-pairing-divern circularization），也叫直接反向剪接：主要机制是前体mRNA两侧的内含子通过碱基互补配对发生环化再切除内含子，从而形成环形RNA（circular intron RNA，ciRNA）；（2）套索驱动环化（lariat-driven circular），也被称为外显子跳读（exon skipping）：主要机制是外显子跳读，即前体mRNA 下游外显子的剪接供体（splice donor，SD）的3′端连接到pre-mRNA上游外显子的剪接受体（splice acceptor，SA）的5′端形成套索结构，然后切除内含子形成环状RNA[9]；（3）内含子两端的互补序列形成环形RNA：而对于内含子来源的环形 RNA则依赖于内含子两端的互补序列形成环形RNA，ciRNA的形成要求5’端剪接位点富含7nt GU序列，3’端富含11nt C序列，两者共同作用使得内

含子首尾相连，形成ciRNAs[6]。其中前两种已得到广泛认可，是ecircRNA主要形成方式，若没有切除内含子则形成EIciRNA[7]。

还有一种学说认为环状RNA通过RNA结合蛋白配对驱动的环化，即由结合在前体mRNA上内含子两侧的互补序列上的RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）相互作用形成环状结构，促进头尾两端的终末连接，最后形成circRNA 或 EIciRNA[10]。

1.2 环状RNA的生物学功能

1.2.1 作为 微小RNA 分子的海绵体

近些年研究发现eiRNA主要存在于细胞质中，可以作为micro RNA的分子海绵从而发挥相应的功能[11]。已知miRNA是由约22个内源性非编码的核苷酸组成，可以和与之互补的mRNA结合，抑制其翻译或促进其降解，从而实现对基因表达的负性调节效果[12]。例如小脑变性相关蛋白1（cerebellar degeneration-related protien 1）的环形反义转录物CDR1as含有大约 70 个 miRNA-7（microRNA-7，miR-7） 的结合位点，可以和miR-7大量结合，抑制其活性导致 miR-7 靶基因的表达水平增加[13]。已有实验表明[14]，CDRlas会损害斑马鱼的中脑功能，产生与miR4敲降类似的效果；而当CDR1as 低表达时，miR-7 的靶基因表达水平也相应降低。因此，CDR1as 又被称为 miR-7 的分子海绵。Hansen等[15]研究发现小鼠睾丸中存在环状Y染色体性别决定区基因 （circular sex-determining region Y，circSRY），该基因含有16个miRNA-138结合位点，可以和miRNA-138结合，抑制其活性，从而调控miRNA-138的表达水平。Zheng等[16]发现环状同源结构域相互作用蛋白凝酶3（circ-HIPK3）作为人类细胞的细胞生长调节剂，可作为mi-RNA的分子海绵，直接结合并抑制活性miR-124表达，已知circ-HIPK3在膀胱癌组织和细胞系显著下调，分别与膀胱癌分级、浸润及淋巴结转移呈负相关，研究发现circ-HIPK3有miR-558两个结合位点，可以充当miR-558的分子海绵[17]。由此可见环状RNA作为miRNA的分子海绵是一种普遍现象。

1.2.2 与蛋白质相互作用

环状RNA具有蛋白吸附功能，可以作为蛋白质海绵发挥功能。Ashwal-Fluss等[18]研究显示环状盲肌基因（circMBL）是由盲肌编码基因第二个外显子环化形成的，其侧翼内含子上有许多盲肌蛋白结合位点。当MBL水平升高时，MBL与pre-mRNA结合，促进MBL编码基因环化形成circMBL，同时抑制MBL基因经典剪接过程来降低MBL的水平；而新生成的circMBL 再吸附多余的MBL，使MBL水平降低，Ashwal一Fluss等发现肌强直营养不良（myotonic dystrophy，MD）可能与上述机制有关。还有CDR1as 和SRY circRNAs可与miRNA 效应因子阿格蛋白（Argonaute， AGO） 相结合，从而被降解[14，19]。

1.2.3 参与细胞周期及细胞衰老调控

例如circ-Foxo3 可以与周期蛋白依赖性激酶2（cyclindependent kinase2，CDK2）、周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclin-denpendent kinase inhibitor1，p21 ）形成复合体，p21可以阻碍CDK2与周期蛋白A、周期蛋白E结合，从而抑制细胞进入细胞周期[9]。circ-Foxo3与抗衰老相关蛋白分化抑制因子1（inhibitor of differentiation -1，ID1）、E2F转录因子1（E2F1）及抗应激蛋白粘着斑激酶（facal adhesion-associated protein kinase，FAK）、低氧诱导因子1α（HIF1α）结合，使ID1、E2F1、FAK、HIFa不能进入细胞核或线粒体中发挥抗衰老作用[20，21]。

1.2.4 参与调控基因的转录

与外显子来源的环状RNA主要存在于细胞质中不同的是，外显子及内含子共同组成的环状RNA（exon-intron circ RNA）、内含子来源的环状RNA（intronic circRNA）主要存在细胞核中，因此ciRNA和EIciRNA可能参与亲本基因的调控[6，7]。其中EIciRNA可以与U1小核糖核蛋白（U1 snRNP）结合形成ElciRNA-U1snRNP复合物，此复合体在与亲本基因启动子上再和聚合酶Ⅱ（P01Ⅱ）结形成ElciRNAU1snRNP-PolⅡ复合体，使RNA polⅡ聚集从而提高亲本基因的转录。例如有研究发现细胞circEIF3J和circPAIP2可以分别与U1 snRNP通过RNA-RNA方式相互结合，顺式调控亲本基因的表达[7]；还有研究发现一些ciRNA（ci-ankrd52，ci-sirt7）也可以与U1小核糖核蛋白（U1 snRNP）、RNA聚合酶Ⅱ结合从而促进基因的转录。锚蛋白重复结构域52（ciankyrin repeat domain52，ci-ankrd52）是来源于 ankrd52的ciRNA，存在于转录点附近，可以与RNA polⅡ结合发挥正向调节作用，从而促进基因的表达，提高ankrd52的转录效率；当ci-ankrd52被特异性敲除之后，ankrd52的转录效率明显降低[6]。

1.2.5 其他

有报道指出环状RNA可以转录翻译蛋白，可能的机制是环状RNA与核糖体结合并通过滚环复制进行翻译[22]；Holdt等[23]研究发现circANRIL可以与一种编码核仁蛋白的基因（pescadillo homolgue 1，PES1）结合，从而抑制PES1与prerRNA结合后介导的核酸外切酶对pre-rRNA的加工，进而影响核糖体的成熟。

2 环状RNA在冠心病发生、发展过程中的生物作用

2.1 环状RNA影响血管内膜的粥样斑块形成

人类全基因组关联分析，染色体9p21.3基因单核苷酸多态性与动脉粥样硬化性心脏病的易感性有关。Burd等[24]发现染色体9p21.3的多态性能影响INK4/ARF基因的转录过程。已知INK4/ARF基因可编码3种已知的抑癌基因p16INK4a、p15INK4b、p14ARF和一条长链反义非编码RNA（antisense non-coding RNA in the INK4 lous，ANRIL）。 其 中 p16INK4a沉默可导致动脉内皮损伤后内膜增厚，p14ARF沉默可导致粥样斑块形成，p16INK4a、p15INK4b参与转化生长因子β（TGF-β）信号通路，其沉默可导致粥样斑块形成[25]。ANRIL可以与多梳蛋白复合物（polycomb repressive complex，PRC）：PRC1、PRC2结合，使PCR1、PCR2与 p16INK4a、p14ARF和 p15INK4a基因结合使组蛋白H3甲基化引起这些基因静默，将导致血管内膜增生、粥样斑块形成等病理性改变。cANRIL是ANRIL转录过程中存在“外显子跳读”现象环化形成的。Holdt等[23]研究发现冠心病患者体内circANRIL/Lin ANRIL比例较高，而且circANRIL 高表达的患者很少发生冠心病。可能是circANRIL可以与PES1结合，从而抑制PES1与prerRNA结合后介导的核酸外切酶对pre-rRNA的加工，进而促进核糖体的成熟，这将导致核仁应激和p53激活，诱导血管平滑肌细胞和巨噬细胞凋亡和增殖抑制，发挥抗动脉粥样硬化作用。

2.2 环状RNA与心肌细胞缺血再灌注损伤

在小鼠缺血再灌煮损伤心肌梗死模型中Geng等[26]发现小脑变性相关蛋白1基因的反义转录环状RNA—CDR1as和miR-7的表达均上调，且两者的表达水平随心肌梗死面积的增大而升高。该研究发现CDR1as过表达可以通过激活caspase-3促缺氧诱导的心肌细胞凋亡，而且CDR1as可以通过上调多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）和转录因子SP1的表达水平来增大心肌梗死的梗死面积，但之后通过miR-7过表达过程使其逆转。已知PARP和SP1均是miR-7的下游蛋白，可以引起细胞凋亡，是细胞凋亡的执行者[26～28]。这表明，miR-7a能够作用于其靶标PAPP和SP1，从而保护心肌细胞免受缺氧诱导凋亡。此外，CDR1as在体内的过表达可能加重MI的发展、增加心肌梗死面积，以及显著上调PARP和SP1，而miR-7a过表达明显减弱了CDR1as诱导的这些变化。

2.3 环状RNA参与血管内皮细胞的调节

ZNF609基因表达产物是锌指蛋白家族成员，其亚型cZNF是内皮细胞高度表达的环状RNA之一。Chang等[29]发现cZNF609可以通过cZNF609/miR-615-5p/MEF2A信号网参与血管内皮功能的调节。已知cZNF609是miR-615-5p的分子海绵，其相互结合抑制miR-615-5p的活性，促进肌细胞增强因子（myocyte enhancer factor 2A，MEF2A）的表达，MEF2A过表达能模拟cZNF609沉默介导的内皮细胞的迁移、管腔形成并保护内皮细胞免受氧化应激或缺氧诱导的凋亡。已知血管内皮细胞功能紊乱和损伤在冠心病的病理形成过程发挥重要作用。研究发现，与健康的志愿者相比，冠心病患者血液中cZNF609的水平下调；相反，冠心病患者血液miR-615-5p表达水平明显升高。因此，cZNF609可能通过调节血管内皮细胞的功能来参与冠心病的保护机制。

2.4 环状RNA参与调节血管平滑肌功能

已知MiR-130a-3p 与冠状动脉硬化成负相关[30]，其表达下调可以导致患有冠状动脉疾病患者的内皮祖细胞功能障碍[31]。TRPM3属于瞬时受体电位（TRP）通道家族，能调节细胞内钙稳态[32]。Pan等[33]在冠心病患者血浆中确定了24个差异表达的circRNAs（18个上调和6个下调）。其中包括 9 个 circRNAs， 即 hsa_circ_0089378，hsa_circ_0083357，hsa_circ_0082824，hsa_circ_0068942，hsa_circ_0057576，hsa_circ_0054537，hsa_circ_0051172，hsa_circ_0032970， 和 hsa_circ_0006323，这些circRNAs是hsa-miR-130a-3p分子海绵，可以抑制hsa-mir-130a-3p表达，使TRPM3的表达上调，进而与胆固醇一起调节血管平滑肌细胞的增殖与收缩，进而影响心脏血管的收缩功能。可能参与变异性心绞痛的形成过程。

2.5 环状RNA作为冠心病诊断的生物标志物

环状RNA是闭合环状结构，不易被RNA酶水解，比线性RNA稳定[4]，广泛存在于体液中且位于细胞内，数量大、序列高度保守，具有组织和时间特异性，容易出膜和进入体液，因此，具有作为疾病诊断标志物的潜质[34]。

Burd等[24]研究发现靠近INK4a/ARF基因位点的反义转录物——ANRIL与动脉粥样硬化存在易感性，其在转录过程中存在“外显子跳读”现象环化形成cANRIL，RNA测序发现大量的环形RNA可以稳定存在于血液中，并且相对容易检测到，可以作为临床潜在的疾病标记物[34]。Zhao等[35]从12例冠心病患者和12名对照者的外周血中提取所有RNA进行circRNA基因检测分析和受试者工作曲线分析发现hsa_circ_0124644的敏感度和特异度最高（分别是86.7%和76.7%）具有生物标志物的诊断价值；当引入了hsa_circ_0098964时，结果表明，hsa_circ_0124644和hsa_circ_0098964组合作为生物标志物对冠心病诊断价值较高。hsa_circ_0124644和hsa_circ_0124644与hsa_circ_0098964相结合的诊断价值高于常规心电图和运动平板实验（Treadmill Exercise Test，TET）， 并 约 等 于 Holter监 测。Zou等[36]用DNA试剂盒从342例男性冠心病患者外周血单核细胞中提取出has-cirrc-0041103，研究发现与健康对照组相比，冠心病患者外周血has-cirrc-0041103明显升高，其敏感度和特异度分别是0.595和0.612，这表明has-cirrc-0041103有望成为冠心病的生物标记物。

3 展望

近年来，环状RNA的研究已经成为一个新的热点，随着研究的不断深入，环状RNA的形成机制、生物功能及在冠心病中的作用已崭露头角，这为冠心病的诊疗提供了一个新的思路，使冠心病的研究向精准医学方向发展，这将更好的造福于人类。然而，由于目前的对环状RNA的研究还处于初期阶段，对于环状RNA是如何在冠心病中发挥作用的、是否会影响冠心病的预后以及是否可以作为冠心病的诊断标记物而在临床上得到广泛应用等，仍是我们未来需要不断探究的问题。