环状RNA hsa_circ_0133159在胶质瘤诊断和预后评估中的临床价值

江苏大学附属张家港澳洋医院神经外科，江苏 张家港 215600

中枢神经系统胶质瘤是最常见的原发性颅内恶性肿瘤，近年来发病率逐年递增，年增长率为1%～2%[1-3]。目前尚不明确胶质瘤的病因，一般认为高剂量电离辐射和特征性基因突变是主要的危险因素。胶质瘤最显著的生物学特性是肿瘤细胞呈浸润性生长，难以完全切除，对化疗耐药，易于复发，并且约80%的复发病灶位于原发灶周围2 cm范围之内，远处复发较少见（1%～5%），但复发时往往伴随生物学恶性进展，由低级别胶质瘤向高级别胶质瘤转化[4]，而高级别胶质瘤5年生存率仅为13%[5]。以手术为主的综合治疗是当前胶质瘤治疗的主流方案，即先行手术切除，再辅以术后放疗和化疗等综合治疗。

随着分子生物学高通量测序技术的发展，目前发现胶质瘤存在明显的基因异质性，是导致术后放疗和化疗疗效存在差异的重要原因。因此，探寻胶质瘤的分子生物学行为，寻找能够早期诊断胶质瘤及判断其预后的分子生物学标志物，对于设计胶质瘤的治疗靶点及策略、延长胶质瘤患者的生存时间、提高患者的生活质量，均具有重要意义。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一种含量丰富、保守、广泛存在的非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）。circRNA首尾连接成环状，无5’帽和3’多聚腺苷酸尾，不易被核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）降解，在体内可以稳定存在[6]。已有研究证实，circRNA参与多种疾病包括肿瘤的发生和发展[7-10]。circRNA具有多种生物学功能，如作为微小RNA [microRNA，miRNA（miR）]与RNA结合蛋白的海绵，通过与转录因子相互作用调控基因表达。此外，circRNA还参与内含子转移以及RNA表观遗传学修饰[11]。因此，深入研究circRNA可以为疾病诊断提供新的生物学标志物，为药物研发和疾病治疗提供新思路和新方向。

随着高通量测序技术的发展，从不同的肿瘤（包括肝癌、结肠癌、宫颈癌等）中筛选出差异表达的circRNA，为后续的深入研究奠定了基础。然而，有关circRNA在胶质瘤中的表达及其功能的研究还较少。本课题组的前期研究利用HTSeq测序平台对6例成胶质细胞瘤组织和6例正常脑组织进行circRNA测序，构建了成胶质细胞瘤circRNA表达谱，并发现hsa_circ_0133159（circRNA-PTPRZ1）在胶质瘤中显著高表达[P＜0.001，错误发现率（false discovery rate，FDR）＝0.005]。图1所示为hsa_circ_0133159在基因组和基因PTPRZ1上的定位及成环信息。

本研究旨在38例不同级别胶质瘤组织和10例正常脑组织中验证hsa_circ_0133159的表达水平，并分析其与胶质瘤患者临床病理特征的相关性，评估hsa_circ_0133159作为生物学标志物在胶质瘤诊断和预后判断中的临床价值。

图1 hsa_circ_0133159在基因组和基因PTPRZ1上的定位及成环信息

1 资料与方法

1.1 病例纳入与排除标准

病例纳入标准：（1）术后病理明确诊断为胶质瘤；（2）术前未接受过放疗、化疗和细胞免疫治疗。病例排除标准：（1）转移性脑胶质瘤；（2）全身感染；（3）同时患有其他肿瘤。

1.2 研究对象

研究对象为2008年12月—2017年3月接受住院手术的38例胶质瘤患者，收集术后胶质瘤组织标本。另选择10例同期住院接受脑出血或脑外伤开颅内减压手术的患者，收集术后正常脑组织标本。

本研究获得本院医学伦理委员会的批准，并取得患者或其家属的书面知情同意。

1.3 hsa_circ_0133159表达的检测

1.3.1 主要试剂与仪器

TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录试剂盒和One Step SYBR®PrimeScript™ RT-PCR Kit Ⅱ购自宝生物工程（大连）有限公司。NanoDrop ND-2000/2000C超微量核酸蛋白测定仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司，StepOnePlus™实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪购自美国Life Tech公司。

1.3.2 组织标本处理与RNA提取

手术过程中，由同一名主刀医师切取脑胶质瘤或正常脑组织，组织标本大小为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗净标本表面血渍，并于15 min内登记编号，置于－80 ℃深低温冰箱中保存备用。

1.3.3 实时荧光定量反转录PCR（quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR）检测hsa_circ_0133159的相对表达量

应用TRIzol法提取组织标本中的总RNA，NanoDrop ND-2000/2000C超微量核酸蛋白测定仪定量测定RNA。使用StepOnePlus™实时荧光定量PCR仪检测hsa_circ_0133159在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达。hsa_circ_0133159特异性引物由上海华津生物科技有限公司合成，上游引物序列为ATGCTGATGGACTACTTACAAAAC，下游引物序列为AACTCCTCCGCTGACACG。以GAPDH的表达量作为内参照，上游引物序列为AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT，下游引物序列为CCCCACTTGATTTTGGAGGGA。扩增条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40个循环。应用2－ΔΔCt法计算hsa_circ_0133159相对表达量。

1.4 资料收集

从本院医疗信息系统中收集所有患者的临床病理资料和影像学资料。

1.5 随访和生存分析

对所有患者进行随访，无失访病例。术后6个月内，每3个月随访1次；此后，每6个月随访1次。随访截止日期为2017年10月30日。随访时复查血常规和肝肾功能，进行增强磁共振成像检查。随访过程中若再次出现头痛、失语和肢体活动障碍等神经功能损伤的临床症状，且影像学证实为肿瘤进展，则诊断为肿瘤复发。影像学上的肿瘤进展根据Macdonald标准判定，即增强磁共振成像显示肿瘤强化影的2大垂直直径的乘积较之前增加超过25%，或者出现新的肿瘤病灶。以肿瘤复发或任何原因所致的死亡为观察终点。无进展生存（progression-free survival，PFS）时间的定义为自患者手术之日起至肿瘤复发或任何原因所致死亡的时间间隔。总生存（overall survival，OS）时间的定义为自患者手术之日起至任何原因所致死亡的时间或随访截止日。

1.6 统计学分析

应用SPSS 23.0软件对数据进行统计学分析。hsa_circ_0133159的相对表达量以表示。hsa_circ_0133159相对表达量与临床病理特征的关系采用单因素方差分析。应用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价hsa_circ_0133159诊断胶质瘤的临床价值。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，logrank法进行预后的单因素分析，检验的因素包括年龄、性别、术前Karnofsky能力状态（Karnofsky Performance Status，KPS）评分、肿瘤病灶数、肿瘤病理分级、肿瘤复发、hsa_circ_0133159相对表达量，COX回归分析进行预后的多因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况

正常脑组织组10例，其中男性6例，女性4例；平均年龄为50.87±3.28岁。胶质瘤组织组38例，其中男性20例，女性18例；平均年龄为52.18±2.92岁；根据世界卫生组织胶质瘤分级标准[12]，低级别（Ⅰ～Ⅱ级）胶质瘤10例，高级别（Ⅲ～Ⅳ级）胶质瘤28例。2组患者的年龄和性别差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 hsa_circ_0133159在胶质瘤组织中高表达

与正常脑组织相比，hsa_circ_0133159在低级别胶质瘤和高级别胶质瘤组织中的相对表达量均显著增加，差异均有统计学意义（3.22±0.94vs8.58±1.92，P＝0.026；3.22±0.94vs23.46±4.18，P＝0.007），见图2。

hsa_circ_0133159相对表达量与胶质瘤患者的年龄、性别、术前KPS评分和肿瘤病灶数均无显著相关性（P＞0.05，表1），而与肿瘤病理分级（P＝0.040）、肿瘤是否复发（P＝0.005）和患者是否死亡（P＝0.004）显著相关。

图2 hsa_circ_0133159在正常脑组织、低级别胶质瘤组织和高级别胶质瘤组织中的相对表达量

表1 hsa_circ_0133159相对表达量与临床病理特征的关系

2.3 hsa_circ_0133159诊断胶质瘤的临床价值

使用ROC曲线评价hsa_circ_0133159诊断胶质瘤的临床价值（图3），曲线下面积（area under curve，AUC）为0.887（P＜0.010），灵敏度为86.8%，特异度为80.0%，截断值（cut-off value）为4.32。根据截断值，将38例胶质瘤患者分为hsa_circ_0133159低表达组（≤4.32，17例）和hsa_circ_0133159高表达组（＞4.32，21例）。

2.4 生存分析结果

平均随访时间为22.45±2.98个月（范围：1～104个月）。与hsa_circ_0133159高表达组相比，hsa_circ_0133159低表达组PFS时间和OS时间均明显延长（中位PFS时间：3.49vs17.53个月；中位生存时间：5.89vs23.28个月），见图4。

2.5 胶质瘤患者预后的单因素分析

单因素分析显示，高KPS评分、单肿瘤病灶、低级别胶质瘤、无肿瘤复发和hsa_circ_0133159低表达胶质瘤患者的PFS和OS优于低KPS评分、多肿瘤病灶、高级别胶质瘤、肿瘤复发和hsa_circ_0133159高表达的胶质瘤患者（P＜0.05，表2）；而年龄和性别与胶质瘤患者的预后无明显相关性（P＞0.05，表2）。

2.6 胶质瘤患者预后的多因素分析

多因素分析发现，hsa_circ_0133159相对表达量是胶质瘤患者的独立预后因素[PFS：相对风险度＝1.268（95%置信区间：1.007～3.459），P＝0.001；OS：相对风险度＝1.252（95%置信区间：1.103～2.422），P＝0.001]（表3）。

图3 hsa_circ_0133159诊断胶质瘤的临床价值

图4 hsa_circ_0133159相对表达量与胶质瘤患者总生存时间（A）和无进展生存时间（B）的关系

表2 胶质瘤患者预后的单因素分析

表3 胶质瘤患者预后的多因素分析

3 讨 论

早在1970年，HSU和COCA-PRADOS[13]就在真核生物细胞质中发现了circRNA。随着高通量测序技术的发展和应用，发现了越来越多在疾病中差异表达的circRNA，同时也发现差异表达的circRNA与多种肿瘤的发生和发展密切相关。由于circRNA首尾连接成环状，不易被RNase所降解，并且在物种之间具有高度保守性，为其作为疾病诊断的生物学标志物奠定了基础。LI等[14]发现，hsa_circ_002059在胃癌中显著低表达，可以作为胃癌诊断的生物学标志物（灵敏度为0.81，特异度为0.62）。WENG等[15]发现，ciRS-7在结直肠癌中的表达量显著增加，并可通过抑制miR-7表达激活下游原癌基因表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和RAF1，促进结直肠癌的发生和发展，因此可以作为结直肠癌预后评估的生物学标志物以及潜在的治疗靶点。同时，在肝癌、乳腺癌和肺癌中均筛选得到特异性表达的circRNA，可作为诊断和预后评估的生物学标志物[16-18]。

为了明确circRNA在胶质瘤中的表达谱以及circRNA在胶质瘤分子生物学行为中的调控作用，本课题组利用HTSeq测序平台对circRNA进行测序，结果发现hsa_circ_0133159在胶质瘤组织中显著高表达。ROC曲线分析结果显示，hsa_circ_0133159相对表达量对胶质瘤具有良好的诊断价值（AUC＝0.887，灵敏度为86.8%，特异度为80.0%）。进一步分析hsa_circ_0133159相对表达量与年龄、性别、术前KPS评分、肿瘤病灶数、肿瘤病理分级、肿瘤复发和生存情况之间的关系，结果发现高级别胶质瘤、肿瘤复发和死亡患者的hsa_circ_0133159相对表达量明显升高。hsa_circ_0133159低表达患者的PFS和OS均显著优于高表达者。ZHU等[19]研究发现，circRNA-circBRAF与胶质瘤患者的预后显著相关。由此提示，hsa_circ_0133159可能作为胶质瘤诊断和预后评估的生物学标志物。

hsa_circ_0133159由PTPRZ1基因转录产生。研究发现，PTPRZ1在胶质瘤干细胞中显著高表达，并且与患者的不良预后显著相关，同时肿瘤相关巨噬细胞分泌物可以通过PTPRZ1信号通路促进肿瘤生长[20]。hsa_circ_0133159可能通过影响宿主基因的表达，进一步影响患者的预后。同时，本课题组前期研究通过对测序数据进行生物信息学分析，发现hsa_circ_0133159表达与PAK1、TUBB4A、STX1A、GLS2和GNG13基因表达显著相关，因此hsa_circ_0133159也可能通过影响上述基因的表达，调控肿瘤的生长。今后，有必要进一步开展体内外实验以研究hsa_circ_0133159影响肿瘤生长的具体机制。鉴于本研究样本量较小，因此还需要扩大样本量或开展大规模、多中心研究以进一步验证本研究的发现。

综上所述，hsa_circ_0133159可能作为一种新型的生物学标志物用于胶质瘤患者的鉴别诊断和预后评估。

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