多发性骨髓瘤微小残留病检测的研究进展*

丁凯 付蓉

近十几年来，得益于多种新型药物的临床应用，多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者的预后获得根本性改善，总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期（progression-free survival，PFS）均有所提高［1-3］。MM患者诱导治疗后的完全缓解率（complete remission，CR）从10%提高至80%［4-5］。患者治疗后能否达到并保持CR直接影响PFS和OS［6］，然而，由于微小残留病（minimal residual diseases，MRD）的存在，使部分已获得CR但MRD持续阳性的MM患者早期复发，相比于MRD持续阴性的患者其PFS和OS明显缩短［7-9］。因此，MM患者治疗后使用敏感度较高的试验方法连续监测MRD并指导临床治疗十分重要，2016年国际骨髓瘤工作组（international myeloma working group，IMWG）建议将MRD监测纳入新的MM治疗疗效评价系统［10］。其他恶性肿瘤的MRD检测方法同样适用于MM患者，需要满足以下几点要求［10］：1）对于异质性较大的MM患者，如寡分泌型、不分泌型和轻链型，具有普遍适用性和可操作的标准化试验流程；2）试验方法的敏感度至少达到10-5，且应具有高度准确性和可重复性；3）试验方法在多中心临床试验中得到证实；4）试验方法对于多数患者具有可行性，检测周期不宜过长，对标本转运条件不能要求过于苛刻。目前尚无试验方法能够满足上述全部要求，但是达到敏感度10-5的多参数流式细胞术（multiparameter flow cytometry，MFC）检测和几种分子学检测方法，随着试验技术的不断发展，有望达到上述标准。本文即对用于MM患者MRD检测的MFC、等位基因特异性寡核苷酸PCR技术（allele-specific oligonucleotide-dependent polymerase chain reaction，ASO-dependent PCR）、新一代测序技术（next-generation sequencing，NGS）、数字PCR技术（digital PCR，dPCR）和外周血检测MRD技术各自的优缺点和最新进展予以综述，期待中国MM患者MRD检测能普遍应用于临床实践。

1 MFC检测MM患者的MRD

MFC在MM患者恶性浆细胞MRD检测的重要性在2008年已被证实，Paiva等［7］研究对非透析的MM患者（non-dialysis MM，NDMM）在治疗后第100天使用4色直接荧光标记浆细胞，其抗体方案为CD38/CD56/CD19/CD45、CD138/CD28/CD33/CD38和 CD20/CD117/CD138/CD38，结果在90%患者中检测到克隆性浆细胞，使用MFC检测MRD是MM患者PFS和OS最重要的独立预后指标，MRD每降低1个对数级，OS约延长1年，中位PFS（median PFS，mPFS）为（71个月vs.37 个月，P＜0.001），中位OS（median OS，mOS）为（NR vs.89个月，P=0.002）。

2013年，欧洲骨髓瘤联盟完成了IX试验［11］，其中部分结果是在英国一个单中心使用6色流式细胞学检测MM患者MRD，抗体方案为CD138、CD45、CD19、CD56和CD27，得出与Paiva等［7］研究相似的结果。试验检测378例接受诱导化疗的患者和397例使用大剂量马法兰+自体干细胞移植100天患者的MRD，计数50万个单个核细胞，以发现5个异常浆细胞为折点，结果显示MRD阴性患者和阳性患者的PFS及OS分别为（28.6个月vs.15.5个月，P＜0.001）和（80.6个月 vs.59个月，P=0.018），敏感度为0.01%，提示MFC检测MRD对于MM患者的PFS和OS具有强烈的预测性。

在随后的几年中，陆续发展了8色到10色的流式抗体组合方案。2012年欧洲血液肿瘤试验基金制定了“欧洲两管8色方案”，两管分别加入CD45/CD138/CD38/CD56、beta-2微球蛋白/CD19/胞质 Ig kappa/胞质 Ig lambda 和 CD45/CD138/CD38/CD28/CD27/CD19/CD117［12］。2014 年，Behdad 等［13］研究使用9色11参数的流式检测，并进行形态学和免疫组织化学的比对，其抗体方案为CD19、CD20、CD38、CD45、CD56、CD117、CD138和胞质轻链，标本要求使用未混血的首份骨髓，EDTA或肝素抗凝，48 h内上机检测。2016年，有研究报道71例自体干细胞移植后患者 5色流式检测 MRD（CD45、CD138、CD38、CD56、CD19）与血尿蛋白电泳、免疫固定电泳和血清游离轻链的比对结果，敏感度为0.01%［14］。

为使MFC检测MM患者MRD标准化，国际临床流式委员会，美国食品药品监督管理局（FDA）和美国国立卫生研究院（NIH）于2014年开始协作，并于2016年最终制定了目前唯一的骨髓瘤患者MRD临床检测指南［15-16］，指南建议使用8色方案，其检测敏感度为10-5～10-4，检测异常浆细胞的基本单抗包括CD38、CD138、CD45和CD19阴性、出现CD56和胞质κ和λ免疫球蛋白轻链。与此同时，异常表达在MM浆细胞上的标志物还有CD20、CD27、CD28、CD117、CD81和CD200，以及最近几年发现的CD54和CD307，其中CD117在正常浆细胞表达极少［17-18］。在抗体荧光颜色的选择上，应注意低表达的标志物选用高敏荧光，如CD56、CD138和CD117；反之亦然，如CD38；在初诊及化疗后随访监测MRD时，应使用同样的抗体方案；因此在初诊时选择高表达的抗体，在后期随访中，易低估MRD［19］。

新一代FCM具有自动识别和分析异常浆细胞的功能。2017年，西班牙科学家发表了新一代FCM与传统 8色 FCM（CD45、CD138、CD38、CD56、CD27、CD19、CD117、CD81）的比对结果［20］。新的抗体组合包括CD38、CD138、CD45、β2微球蛋白、胞质κ和λ。结果显示，经典FCM检测MRD阴性患者有25%新一代FCM检测结果为阳性，较其他75%患者PFS明显缩短，而且检测时间＜4 h，需要骨髓量平均1.5 mL，敏感度达到10-6。提示随着新药物的发展，使用单克隆抗体药物治疗的患者，如CD38和CD138单抗，应调整 抗 体 组 合 为 CD54、CD229、CD269、CD319 和VS38c［21］。其中CD229是新确定的浆细胞表面标志物，在MRD检测中有望取代CD38和CD138［22］。

在细胞计数方面，检测MM患者MRD不能＜50万个细胞，建议计数≥200万个细胞［17］。新版分析软件可以在预置海量临床数据的前提下自动生成个体化的抗体组合方案［18］。

2 ASO-PCR检测MM患者的MRD

目前所有检测MM患者MRD的分子生物学方法均利用个体化的肿瘤免疫球蛋白基因重排作为检测靶点。其中ASO-PCR又分为多种，包括定性ASOPCR、定性巢式ASO-PCR、定量限制稀释PCR和实时定量ASO-PCR（ASO-RQ-PCR）［23-24］。因 ASO-RQPCR操作简单且可定量，使用最为普遍。多项研究表明，以10-5～10-4为折点，使用ASO-RQ-PCR检测MM患者MRD，能够较好地预测患者预后，且对于不同方案诱导化疗、巩固化疗和自体及异基因干细胞移植患者均适用［9，23，25］。

ASO-RQ-PCR检测MM患者MRD主要分为两步。第一步是使用定性PCR方法多引物扩增检测出每例患者特定的恶性浆细胞克隆性免疫球蛋白基因重排［26］。多种免疫球蛋白基因重排可以作为检测靶点，包括IGH全VDJ重排、IGH不全DJ重排、IGK缺失、IGK VJ重排和IGL VJ重排［27］。检测出的PCR条带随后采用Sanger法测序，即可得到患者特异性的克隆性浆细胞互补决定区3（CDR3）的序列。第二步是使用特异性的ASO引物或探针对患者CDR3序列进行 RQ-PCR 检测［28］。

ASO-RQ-PCR目前在欧洲已经实现完全的标准化检测，在不同实验室之间数据具有可对比性，而且敏感度在 10-5以上，实用性较 NGS更强［10，29］。但是，也存在局限性。首先，目前使用的引物模板库是由ALL患者MRD检测演化而来，处于B淋巴细胞发育终末期的浆细胞，在生发中心接受抗原刺激后，免疫球蛋白基因重排会再次发生体细胞高突变（somatic hyper mutation，SHM），造成引物模板库使用效率大幅降低，对于ASO-RQ-PCR的两个步骤，即突变鉴定和实时定量扩增均有较大影响［25，27］。解决该问题需使用患者特异性引物或探针，使成功率提高至90%以上。而且由于骨髓单个核细胞中浆细胞比例较低，可使用CD138+分选的浆细胞进行下一步实验，也可大幅提高成功率［30］。其次，RQ-PCR往往需要反复建立标准曲线，造成DNA标本大量消耗，可以使用质粒扩增患者特异性的免疫球蛋白重排序列［27］。

3 NGS检测MM患者的MRD

NGS是一种高通量测序方法，利用引物库中的多种引物对标本中每个浆细胞特异的IgH基因平行测序，研究其基因多样性［31］。2009年Dana Farber牵头的多中心联合临床试验中，使用NGS检测246例维持治疗前和178例维持治疗后的MM患者MRD［32］。以10-6为折点，对于维持治疗前患者MRD阴性组vs.MRD阳性组3年PFS为83%vs.53%，维持治疗后为90%vs.59%，呈显著性差异。多项试验表明，NGS-MRD阴性患者具有更深层次的缓解，预后明显更佳［33］。

相比于ASO-RQ-PCR，NGS有下述几点优势：1）NGS敏感度达到10-6，较ASO-RQ-PCR高出一个对数级［34］；2）NGS检测MM患者的MRD适用性可达到90%，使用CD138+分选后甚至更高［35-36］；3）NGS可使用一致的引物模板库，不同于ASO-RQ-PCR必须使用患者特异性的引物或探针，节省了时间和人力［36］；4）NGS可捕捉几乎所有免疫球蛋白基因重排，因此可以捕捉亚克隆和克隆演变，进而监测MM患者达到深度缓解后的寡克隆骨髓瘤细胞和寡克隆免疫重建［37］；5）NGS不需要建立标准曲线，减少样本DNA的消耗，且试验周期更短。

尽管优点突出，局限性同样明显。1）使用NGS检测MM患者的MRD目前仅有两个商业平台，LymphoSIGHT和ImmunoSEQ其他实验室并未广泛开展［33］；2）不同于ASO-RQ-PCR、NGS的实验设计和数据解读尚未国际标准化；3）与ASO-RQ-PCR一样，NGS实验同样受到SHM的干扰；4）仍有NGS检测不到的克隆重排。总之，NGS检测MRD阴性一定提示更深层次的缓解，适用于已达到CR患者的预后评估。

4 dPCR检测MM患者的MRD

dPCR首创于20世纪90年代，由Vogelstein和Kinzler于1999年命名，近几年开始逐渐应用于临床，目前dPCR已经用于检测血液恶性肿瘤的MRD［38］。dPCR的基本原理就是将一份标本稀释分割成几百到几百万份，分别进行PCR反应，每小份标本中仅有几个目标拷贝，然后使用泊松分布的方式分析数据，精准计算出目标拷贝量［39］。目前，两种商业化的dPCR设备可供使用，分别为基于液滴和芯片的dPCR。

根据目前的研究，dPCR在准确性和敏感度均与ASO-RQ-PCR相当［40］。dPCR是对目标DNA的绝对计数，不需要DNA稀释后的标准曲线。但是dPCR尚未实现标准化，不同研究的折点数据差异较大。2017年，Alikian等［41］对比了目前3个dPCR平台，Quant Studio 3D（Thermo Fisher）、QX200（Bio-Rad）和Rain Drop（RainD ance），仅 QX200（Bio-Rad）未检测出假阳性结果。同时，与ASO-RQ-PCR一样，dPCR前序步骤也需要克隆鉴定、CDR3识别和ASO引物，因此在适用性和不能检测克隆演变方面均会存在前述同样的问题。

使用dPCR检测MM患者的MRD，目前研究尚少。Drandi等［42］研究18例MM患者，均使用ASORQ-PCR和液滴dPCR（Bio-Rad公司的QX100平台）同时检测到IGH克隆重排患者。结果显示两者的检测敏感度均达到10-5；在18例患者的95份标本中，二者检测的一致性为81%；在不一致的18份标本中，有16个为dPCR阳性，但是ASO-RQ-PCR为阴性。目前为止，对于dPCR检测MM患者MRD对预后的影响尚无研究。

5 外周血检测MM患者的MRD

如前所述的MRD检测方法均是基于患者的骨髓标本，患者需要接受有创的骨髓穿刺检查。而克隆靶向多肽技术是以外周血血浆为标本，在患者初诊鉴定出特异性多肽，然后使用质谱分析检测MRD的一项技术［43-44］。该技术敏感度甚至高于使用骨髓标本的其他方法，但与临床的相关性尚未验证，且在各实验室之间难以达到标准化。其优点为有创性降低，但仍需在初诊检测基线数据时行骨髓穿刺；在瘤负荷极低时仍可使用；且规避了骨髓瘤细胞髓内灶性生长，骨髓穿刺可能遗漏肿瘤细胞的缺陷［45］。Korthals等［46］也曾研究使用IgH-qPCR检测外周血MRD水平，发现外周血MRD水平比骨髓MRD水平低40倍，且与血清学缓解无相关性，但外周血MRD阴性可改善患者PFS。有关脂肪活检及microRNA检测MM患者MRD的方法尚在研究中，其价值还未确定［47-48］。

6 结语及展望

检测MM患者MRD的终极目标为治愈疾病。如何定义MRD，将检测技术标准化且普及，将决定患者个体化治疗方案的制定。截至目前，各种方法均存在优缺点和局限性，尚无标准化的检测方法，且缺乏大样本循证医学的证据。总体而言，目前检测MM患者MRD的技术敏感度已达到10-5，但仍存在普遍适用性和个体特异性检测的矛盾，且对标本质量均要求较高。另外，本文综述的所有方法均无法探查髓外恶性浆细胞。如实体肿瘤在内的其他肿瘤疾病一样，MM患者MRD的检测技术仍处于发展阶段。综上所述，连续监测患者MRD，伴随新药研发和多药联合方案的出现不断调整治疗方法并修正治疗指南，将有助于治愈恶性肿瘤。