活血化瘀中药调控细胞自噬抗动脉粥样硬化的研究进展

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社会经济的发展和人民生活水平的提高使动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)性心脑血管疾病已成为严重危害人类健康的第一杀手。AS以进行性脂质沉积、纤维组织增生和炎性细胞浸润为特征，是多种急慢性疾病如冠心病、脑梗死等的共同病理学基础，抗AS研究一直是心血管病领域的研究热点。抗AS研究主要从调节脂质代谢、抗炎、保护血管内皮等方面探讨。细胞水平的胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport，RCT)作为维持胆固醇动态平衡的关键环节被逐渐深入研究。研究发现适度细胞自噬 促进巨噬细胞胆固醇流出而影响RCT过程[1]，当自噬被抑制时RCT过程也被终止，证实细胞自噬是RCT的关键一环。另有研究发现自噬能够保护血管内皮细胞稳定减少其死亡，减少平滑肌细胞吞噬脂质及无序增殖，能够通过多环节发挥抗AS作用。细胞自噬在AS研究逐渐深入，现已发现自噬能够通过参与RCT、抗炎保护血管内皮、抑制平滑细胞增殖起到抗AS作用。

1 自噬在AS中的作用

自噬是真核细胞利用溶酶体降解细胞内受损的细胞器、蛋白等大分子物质的过程，在营养不良、缺氧、氧化应激、DNA损伤等环境压力下被激活。机体可通过自噬回收利用内源性细胞成分(氨基酸、游离脂肪酸、核苷酸)以维持细胞稳态[2]。按照细胞内物质进入溶酶体途经的不同， 自噬可分为3类[3]： 微自噬 、巨自噬和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)，通常所说的自噬即指巨自噬。典型的自噬始于双层膜结构的形成，即吞噬泡形成。吞噬泡包裹细胞内需要降解的蛋白聚集体、脂滴及细胞器，并逐步延伸、成熟，形成自噬体，之后与溶酶体融合形成自噬溶酶体。自噬体外膜与溶酶体膜融合后，溶酶体水解酶降解自噬体内膜及底物，生成可被细胞循环利用的代谢产物。

既往细胞自噬多用于肿瘤等相关研究，近年发现其与多种心血管病有密切联系，包括缺血/再灌注损伤、AS、心律失常、高血压、心力衰竭等心血管疾病均与之相关，而AS与自噬的研究也逐年增多并日益深入。AS起始于脂质代谢紊乱，内皮损伤使脂蛋白浸润血管壁，巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞，最后平滑肌细胞增殖、管壁增厚失去弹性。脂质负荷可激活自噬作用，将脂滴运往溶酶体接受脂酶的处理，这一过程动员了胆固醇外流，研究发现抑制巨噬细胞的溶酶体活性仅影响脂质超载细胞内的胆固醇流出而对正常细胞无影响，提示自噬仅在泡沫细胞的溶酶体降解中发挥特异性作用。当抑制自噬过程时胆固醇的外流减少，但破坏溶酶体其他组成时胆固醇的外流未受影响[1]，这提示自噬是胆固醇流出细胞的必要过程，通过参与RCT可发挥抗AS作用。

2 自噬相关通路及蛋白的研究

细胞自噬主要受以下两条信号通路的调控。①Ⅲ型磷脂酰肌醇-3 激酶 (class Ⅲphosphatidylinositol 3-kinase， class Ⅲ PI3K)/beclin-1 通路的正性调控：在饥饿、氧化应激、缺血等应激情况下，Ⅲ型PI3K 通过与beclin-1 结合在细胞质膜上参与调控自噬囊泡的形成；②Ⅰ型磷脂酰肌醇-3 激酶(classⅠ phosphatidylinositol 3-kinase， class Ⅰ PI3K)/AKT [又称蛋白激酶B (protein kinase B， PKB)]/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)通路的负性调控：在营养充足的情况下，该信号通路处于活化状态，进而通过抑制自噬过程关键蛋白自噬相关基因1 (autophagy-associated gene 1，ATG1) 而抑制自噬反应。在营养不良或在mTOR 抑制剂( 如雷帕霉素) 存在的情况下，mTOR活性受抑，ATG1 可形成一个ATG1 蛋白激酶自噬调节复合物，进而启动自噬反应[4]。AS发生于大量脂质摄入或脂质代谢紊乱情况下，以PI3K/AKT/mTOR通路负向调控细胞自噬过程为主，故这一通路在AS相关研究中意义较大。

30多种自噬相关基因(autophagy-associated gene，ATG)编码的特殊蛋白参与吞噬泡的成熟、延伸，自噬体与溶酶体的融合从而促进自噬完成，其中包括Beclin 1、微管相关蛋白(LC3)-Ⅱ、ATG5-ATG12复合物等[5]。根据其在自噬过程中表现出的功能差异，ATG可分为5类： Atg1复合物[Atg1/ULK1(unc51-like kinase 1)]、Atg9/mAtg9、Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase， PI3K)复合物、Atg5-Atg12-Atg16L复合物及Atg8/LC3复合物。其中与自噬关系密切，机制确定的特异蛋白常被用于自噬相关实验，如LC3-Ⅱ、Beclin1等。在营养充足时， 生长因子激活Ⅰ型PI3K， 从而通过Akt/PKB(protein kinase B)通路激活哺乳动物mTOR。活化的mTOR抑制了Atg1/ULK1， 从而抑制自噬。而在营养不良或mTOR抑制剂(如雷帕霉素)存在的情况下，mTOR受到抑制，ULK1-Atg13-FIP200复合体激活并从细胞质转移到内质网， 诱导自噬发生。多项实验均证明，mTOR抑制剂能够减少脂质沉积，诱导自噬及巨噬细胞胆固醇流出[6]。自噬体形成期主要受两种蛋白系统的调节： Atg5-Atg12-Atg16L复合物和Atg8/LC3复合物[7]。其中Atg8， 也称为LC3，LC3前体合成以后，立即被水解为活化的LC3-Ⅰ，并随后与磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine， PE)结合形成LC3-Ⅱ。细胞内LC3的含量及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化量可以看作是自噬发生的依据，LC3-Ⅱ的相对量可看作自噬体的含量[8]。Beclin1是调节细胞自噬和凋亡机制的重要分子。它能够介导其他自噬相关蛋白定位于自噬前体，在自噬过程中起到关键调控的作用，Beclin1 表达缺失或下调就会降低细胞自噬活性。只有在Beclin1-Bcl-2/Bcl-xL复合体定位于内质网时才具有抑制自噬的作用[9]。LC3-Ⅱ及Becilin1可视为自噬的正相关蛋白，而mTOR则与自噬水平负相关。

3 调控细胞自噬抗AS的研究现状

现有关于自噬与AS的研究以机制研究为主，通过特定相关基因敲除技术设计特定自噬缺陷模型可推出自噬在抗AS中的作用。因巨噬细胞是细胞自噬参与抗AS作用最直接的场所，以细胞自噬为切入点的抗AS研究多以巨噬细胞为研究对象。多项自噬促进剂如雷帕霉素等抗AS研究取得成功，一些特异性的蛋白或酶也表现出促进自噬抗AS的特性[10-11]，这些酶包括精氨酸酶2、亲环素A等多种蛋白，机制可涉及mTOR和PRKAA/AMPK信号通路，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和PI3-激酶通路。在一系列相关研究中发现适度在自噬参与抗AS作用中异常重要，自噬能够促进抗炎、胆固醇流出等有益过程，也能在过度激活时因对心肌细胞损伤而产生负面作用[12]。

现已证明能够促进细胞自噬功能的中药有姜黄素、白藜芦醇、熊果酸、木樨草素等[13-16]。白藜芦醇能够升高LC3水平，下调自噬相关蛋白p62 水平，从而通过诱导自噬保护受损巨噬细胞缓解AS[17]。姜黄素衍生物烟酸姜黄素也是通过抑制PI3K/Akt/mTOR 通路来激活自噬，提高LC3Ⅱ水平，降低p62 水平，恢复自噬通量，对抗氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)造成的不良影响，减少泡沫细胞形成，减缓AS进展[18]。基本为中药单体成分，鲜有临床应用广泛的药物，中药复方促自噬抗AS相关研究则刚刚起步，在体内外均证明可以通过细胞自噬机制抗AS的研究未见报道。已有体外研究证实益气活血药物可参与体外细胞自噬过程[19]。另有报道初步证明搜风祛痰中药可调节自噬相关蛋白beclin1和LC3从而影响AS斑块稳定性[20]，但研究指标过于单一，未见深入报道。

4 活血化瘀中药抗AS机制研究现状

中医学中无AS这一病名，根据临床表现及病理变化，本病多属于“瘀证”“脉痹”等病证的范畴，病至后期出现相应器官病变时，则可属于“中风”“胸痹”“坏疽”等病证范畴。病因多为膏粱厚味、饮食失节；易出现病情突变，表现为固定部位疼痛等特点。其病机主要为“血脉瘀阻”。《素问·痹论篇》云：“痹在于脉……则血凝而不流”，“心痹者，脉不通”，提示“血凝而不流”是AS的主要病机。活血化瘀是中医治疗AS的有效治法，针对炎症反应的“毒”认识，解毒活血法治疗AS易损斑块疗效确切。临床及实验证明，活血化瘀单药及复方能够通过多种机制达到抗AS作用，这些机制涉及调脂、抗炎、保护细胞内皮、降低血液黏稠度等多个方面。

单味活血化瘀药或活血化瘀复方可以通过促进血液循环，减小血流阻力，降低血液黏稠度，从而稳定并逆转动脉斑块，发挥对AS的防治效果，活血化瘀药能调节血液中脂质的代谢，改善血流动力学指标。蒋世伟等[21]发现通脉化浊汤可升高血中高密度脂蛋白(high density lipoprotein， HDL)水平，在调节脂质代谢功能方面表现出良好的疗效，证实了其临床防治AS的效果。同为活血化瘀代表组方的补阳还五汤则通过改变AS模型大鼠血液流变学指标，增强血液流动性，抑制凝血因子以降低血液黏稠度，加速代谢来降低血液中脂质水平，起到抗AS的作用。活血化瘀药能够稳定或消退动脉斑块[2]。丹蒌片能够在降低AS兔血脂的同时，减少单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1， MCP-1)及细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1， ICAM-1)等炎症因子的表达水平从而维持斑块的稳定[23]。RCT是外周细胞，尤其是泡沫细胞内胆固醇重新回到肝脏代谢的过程，能够减少泡沫细胞阻止斑块形成甚至逆转斑块，是调节脂质研究的新靶点。丹红注射液则能够调节RCT相关蛋白表达，介导更多的细胞内胆固醇外流，抑制AS斑块前体的形成，控制斑块进展[24]。

5 芎芍胶囊抗AS研究进展及通过调控细胞自噬抗AS的研究展望

国家“八五”攻关期间，活血化瘀药血府逐瘀浓缩丸有明确抗AS疗效，其后逐渐精简选择方中两味主药川芎、赤芍，采用正交设计确定剂量配比关系，提取有效成分(主要是川芎总酚和赤芍总苷)进行观察研究(国家“十五”科技攻关项目：No.2001BA701A20)最终形成芎芍胶囊。临床研究显示在西药常规治疗基础上加用芎芍胶囊，对经皮冠状动脉介入术(PCI)术后再狭窄可以起到较好的防治作用。方中川芎辛温而燥，善于行走，能化瘀滞，开血郁，上行头目，下达血海，为血中气药。赤芍通利血脉，其性偏凉，可制川芎温燥之性。川芎与赤芍，性虽有寒热之殊，而功有行血破滞之同，两药合用可发挥协同作用使机体气血运行正常，营卫生化有度。实验研究发现其能够抗血小板黏附聚集，降脂，抑制平滑肌细胞增殖，预防血管重构从而延缓AS进展。芎芍胶囊能够促进胆固醇跨膜转运，保护HDL功能，促进RCT进行最终增加胆固醇流出，抗AS作用确切[25-27]。其中对亲环素影响巨噬细胞自噬过程的体外研究发现，适度的亲环素浓度才能发挥促进细胞自噬的作用，这与芎芍胶囊对AS兔亲环素A的影响研究中的实验结果不谋而合[25，28]。

细胞自噬促进细胞胆固醇流出是RCT的起始关键环节，已发现芎芍胶囊能够影响促进细胞自噬过程相关蛋白，其是否影响细胞自噬过程从而促进RCT？针对这一问题以巨噬细胞自噬作用为切入点，通过体内与体外实验相结合，探讨芎芍胶囊以巨噬细胞自噬为作用靶点，揭示其通过影响细胞自噬，促进巨噬细胞胆固醇流出，参与RCT过程的抗AS分子机制，是一项有临床意义的研究方向，可为中医药防治AS疾病提供新的科学依据。