山茱萸新苷抑制EAE模型大鼠中枢神经系统免疫细胞浸润及VCAM-1表达的研究

张荣博 徐 彬 朱敏姿 周未莹 吴 忧 梁顺利 章水晶 李 铮 袁 强

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）为中枢神经系统脱髓鞘病，实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是其常用动物模型，发病机制均为CD4+T细胞介导的细胞免疫[1-2]。EAE模型中枢神经系统血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）显著增加，在介导T细胞通过血脑屏障侵入中枢神经系统过程中起重要作用[1，3-5]。山茱萸新苷可以在体外抑制脐静脉表达VCAM-1[6]，本研究拟明确山茱萸新苷能否在EAE动物活体内抑制中枢神经系统表达VCAM-1，抑制免疫细胞浸润，缓解EAE神经功能缺损症状。

1 实验材料

1.1 实验动物 成年雄性Lewis大鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2010-0002]32只，SPF 级，体质量（360±10）g。普通级雄性DHP豚鼠 [浙江省湖州城区西风洋特种经济动物养殖场，许可证号：SCXK（浙）2013-0060]5只，体质量（300±8）g。

1.2 主要试剂 山茱萸新苷（成都普菲德生物技术有限公司，批号131015），福氏完全佐剂（Sigma公司，批号SLBK1731V），兔抗鼠VCAM-1多克隆抗体（Santa Cruz公司，批号K0212），山羊抗兔IgG二抗（Santa Cruz公司，批号B1711），Trizol（Bio Basic公司，批号 40950732），逆转录试剂盒（TaKaRa公司，批号CK1010），组织总蛋白提取试剂盒（Thermo Pierce公司，批号 PD199707）。

1.3 主要仪器 CFX384多重实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司），Mini-PROTEAN电泳系统及Mini Trans-Blot转印系统（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 动物模型制作 参考尹琳琳等[7]方法。取豚鼠5只，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，剥离脊髓，剪除脊膜和马尾，研磨制作50%的豚鼠脊髓匀浆。取两个10mL注射器，一个抽取豚鼠脊髓匀浆5mL，另一个抽取福氏完全佐剂5mL，用三通管对接，低温下反复抽打乳化至油包水乳剂，放入4℃冰箱中备用。诱导EAE时，予Lewis大鼠皮下注射油包水乳剂（每只大鼠每个后足垫各注射0.1mL）。注射当天记为免疫后第0d，第二天记为免疫后第1d。每只大鼠仅在第0d注射1次油包水乳剂。

2.2 动物分组及处理 将Lewis大鼠随机均分为正常对照组、模型组、强的松组和山茱萸新苷组，每组8只。后三组大鼠均制作EAE模型。正常对照组、模型组予灌胃生理盐水；山茱萸新苷组予含有山茱萸新苷（135mg/kg）的生理盐水灌胃；强的松组，予含有醋酸泼尼松龙（5mg/kg）的生理盐水灌胃。以上组别均在免疫后第1d开始灌胃，1天1次，每次液体量均为1.5mL。

2.3 神经功能缺损症状评分 采用Corrêa等[8]的标准评分，0分：无神经功能缺损症状；1分：出现尾巴肌张力明显减弱甚至消失，步态笨拙；2分：可见尾巴麻痹无力，双后肢肌张力明显减弱；3分：可及尾巴麻痹无力，后肢明显瘫痪，疼痛等刺激后能移动；4分：前肢也出现瘫痪，伴大小便失禁；5分：接近死亡或者已经死亡。比较各组大鼠免疫后第14d神经功能缺损症状评分。

2.4 组织病理学观察 免疫后第14d（有大鼠表现双后肢明显瘫痪并累及前肢，精神非常萎靡，进食不能的濒死状态，视为神经功能缺损症状达到最高峰）处死所有大鼠。快速取出脊髓并分段，新鲜颈胸段脊髓（每组8段）放入液氮，每组取4段进行实时定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-PCR），另外 4段进行Western Blotting。腰段脊髓（每组8段）制作石蜡切片，厚度4μm。每只大鼠从腰髓切片中随机选取3张行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，低倍镜下观察全视野的病灶数后取平均数，即为每只大鼠的病灶数。炎性病灶判定：超过20个炎症细胞浸润或炎症细胞围绕小血管呈袖套样改变[9]。

2.5 RT-PCR检测颈胸段脊髓VCAM-1mRNA表达 使用软件设计PCR引物。Rat VCAM-1，基因序列号NM_012889，上游引物5'-GATGTCATTGCGAGGTCGTTTAGA-3'，下游引物5'-GCATGAAGTTACAACAGTCAGTCCAAG-3'，扩增长度 97bp。Rat 18S（内参），基因序列号M11188，上游引物5'-GAATTCCCAGTAAGTGCGGGTCATA-3'，下游引物5'-CGAGGGCCTCACTAAACCATC-3'，扩增长度105bp。

将分段好的新鲜颈胸段脊髓（每组4段）分别于液氮中研磨，提取总RNA，再逆转录合成cDNA。反应条件：95℃预变性 1min；40个循环：95℃，15sec；63℃，25sec；熔点曲线分析 55～95℃。目的基因的相对表达水平用相对表达量（2-△Ct×103）表示。

2.6 Western Blot检测颈胸段脊髓VCAM-1蛋白的表达 新鲜颈胸段脊髓（每组4段）分别在液氮中研磨，提取总蛋白并定量，再经电泳、转膜（100V恒压下转膜至聚偏二氟乙烯膜）、封闭（5%脱脂奶粉），加入一抗（兔抗大鼠VCAM-1多克隆抗体，稀释倍数1：500）4℃孵育过夜，加入二抗（山羊抗兔 IgG，稀释倍数1:2000）室温孵育。配置ECL工作液（约1mL），孵育转印膜1min，保鲜膜密封，暗盒中曝光5～10min后显影和定影。VCAM-1蛋白的相对表达量=VCAM-1蛋白（光密度值）/内参（光密度值）×103。

2.7 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件，计量资料以（±s） 表示，采用单因素方差分析。多个样本均数间的两两比较方差齐时采用LSD法，若方差不齐则采用Tamhane's T2法。检验水准：α=0.05。

3 结果

3.1 各组大鼠神经功能缺损症状评分比较 免疫后第14d有3只大鼠出现濒死状态，视作症状达到高峰期。正常对照组、模型组、强的松组和山茱萸新苷组神经功能缺损症状评分分别为：0分、（3.83±0.98）分、（0.67±0.82）分、（1.67±1.75）分，组间差异有统计学意义（F=14.314，P=0.000），山茱萸新苷组与模型组比较差异具有统计学意义（P=0.002），与强的松组比较差异无统计学意义（P=0.126）。

3.2 各组大鼠腰髓免疫细胞浸润及病灶个数比较模型组、强的松组、山茱萸新苷组大鼠腰髓均有免疫细胞浸润，密集分布在血管周围。山茱萸新苷组腰髓免疫细胞浸润数量明显少于模型组，稍多于强的松组，正常对照组腰髓极少有免疫细胞，见图1（插页）。四组大鼠炎性病灶个数的差异有统计学意义（F=40.996，P=0.000），其中山茱萸新苷组与模型组比较差异有统计学意义（P=0.037），见表1。

图1 各组大鼠腰髓免疫细胞浸润及病灶个数

3.3 各组大鼠VCAM-1mRNA表达比较 四组大鼠颈胸段脊髓内VCAM-1mRNA表达量差异有统计学意义（F=137.485，P=0.000），其中山茱萸新苷组与模型组相比差异有统计学意义（P=0.012）。表明山茱萸新苷可在EAE动物活体内抑制中枢神经系统中VCAM-1mRNA的表达。见表1。

3.4 各组大鼠颈胸髓VCAM-1蛋白表达比较 四组大鼠颈胸段脊髓VCAM-1蛋白表达量的差异有统计学意义（F=54.594，P=0.000），山茱萸新苷组VCAM-1蛋白的表达明显少于模型组（P=0.004）；山茱萸新苷组与强的松组VCAM-1蛋白表达差异无统计学意义（P=0.082）。见表 1、图2（插页）。

图2 各组大鼠脊髓VCAM-1蛋白表达比较

4 讨 论

MS中医辨证以肝肾阴虚为主，滋补肝肾贯穿治疗始终[10-11]。山茱萸补肝益肾、涩精固脱，在治疗MS中发挥重要作用[12]。含山茱萸的汤剂及山茱萸环烯醚帖苷均有缓解MS/EAE症状的作用[9，13-14]。山茱萸新苷属于山茱萸环烯醚萜苷，本研究证实在症状高峰期，山茱萸新苷组神经功能评分明显低于模型组（P<0.01），说明山茱萸新苷具有缓解EAE神经缺损症状作用。

表1 各组大鼠脊髓炎性病灶个数、VCAM-1mRNA、VCAM-1蛋白表达比较（±s）

表1 各组大鼠脊髓炎性病灶个数、VCAM-1mRNA、VCAM-1蛋白表达比较（±s）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；VCAM-1：血管细胞黏附分子-1

组别正常对照组模型组强的松组山茱萸新苷组F值P值鼠数8888炎性病灶个数（个）08.75±2.23△△2.33±1.03△**4.83±1.47△△*40.9960.000VCAM-1mRNA相对表达量5.602±0.76137.762±4.560△△17.143±1.521△△**28.042±3.147△△*137.4850.000VCAM-1蛋白相对表达量7.958±2.26522.433±1.829△△15.725±1.338△△**18.625±0.874△△**54.5940.000

MS/EAE主要由CD4+T细胞介导，髓鞘特异性的CD4+T细胞输注入正常小鼠体内，可诱导EAE[15]。髓鞘特异性CD4+T细胞在淋巴器官中发育成熟后释放到血液中，随血液到达中枢神经系统，穿过血脑屏障浸润中枢神经系统并由抗原提呈细胞激活，通过细胞-细胞接触、分泌促炎细胞因子来活化抗原提呈细胞，促炎细胞因子的分泌可以诱发大量免疫细胞浸润中枢神经系统，并在中枢神经系统中激活、分泌大量炎症因子，进而导致周围神经组织损害[2]。本研究应用HE染色，在EAE大鼠的腰髓切片上，可观察到大量免疫细胞浸润。山茱萸新苷组免疫细胞浸润明显少于模型组大鼠，说明山茱萸新苷可以抑制免疫细胞浸润EAE大鼠中枢神经系统。

CD4+T细胞通过血脑屏障浸润中枢神经系统是致病关键，阻止该过程可抑制EAE病理过程。VCAM-1蛋白与配体整合素α4β1结合，介导白细胞招募、淋巴细胞归巢，在EAE发病过程中表达增多，并在介导T细胞通过血脑屏障进入中枢神经系统过程中起重要作用[1，3-5]。针对 VCAM-1配体的 α4亚单位的抗体那他珠单抗可减轻MS的症状[16]。因此抑制VCAM-1的表达有望抑制免疫细胞浸润中枢神经系统进而缓解EAE症状。本研究证实，山茱萸新苷可以在EAE大鼠体内在mRNA及蛋白水平抑制中枢神经系统表达 VCAM-1（P<0.05，P<0.01）。

本研究显示，山茱萸新苷可以显著缓解EAE大鼠神经功能缺损症状，抑制免疫细胞浸润中枢神经系统，以及抑制中枢神经系统表达VCAM-1。然而，山茱萸新苷抑制VCAM-1表达的机制尚不清楚。研究证实，激活核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）可以上调 VCAM-1的表达，抑制 NF-κB的活性可抑制TNF-α诱导的VCAM-1表达[17-18]。既往有研究显示山茱萸新苷可抑制NF-κB的活性[19]。所以，山茱萸新苷有可能通过抑制NF-κB的活性，从而抑制中枢神经系统表达VCAM-1，进一步抑制炎性细胞浸润，缓解EAE症状，但仍需实验研究证实。

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