加味蒌石汤对肾阴虚型PCOS模型小鼠卵泡抑素及激活素的影响

侯晶艳 傅 萍

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育龄期妇女常见的内分泌失调性疾病，涉及的病理机制十分复杂，临床主要表现为高雄激素血症和稀发排卵或慢性无排卵[1]，占无排卵性不孕的30%～60%[2]。加味蒌石汤是杭州市中医院中医妇科傅萍教授在汲取其师何子淮先生诊治经验及刘奉五老先生“瓜石汤”之义制定的，由石斛、瓜蒌仁、熟地、天冬、麦冬、玉竹、菟丝子、当归、丹参等组成，临床用于治疗肾阴虚型PCOS多年，能显著提高患者的排卵率和妊娠率[3]。本研究观察加味蒌石汤对肾阴虚型PCOS模型小鼠体质量、阴道脱落细胞、血清性激素水平、血清卵泡抑素（FS）、激活素（ACT）含量及环磷酸腺苷（cAMP）/环磷酸鸟苷（cGMP）的影响，探讨加味蒌石汤治疗肾阴虚型PCOS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 21日龄SPF级雌性ICR小鼠54只，由浙江中医药大学动物实验中心提供；生产合格证号：SCXK（沪）2013-0016。

1.2 药品与试剂 加味蒌石汤（石斛12g，瓜蒌仁20g，熟地 12g，天冬、麦冬各 10g，玉竹 15g，菟丝子24g，当归12g，丹参15g）由浙江省杭州市中医院中药房提供；硫酸脱氢表雄酮（DHEA）粉剂：由美国solarbio公司提供，纯度≥99.5%，批号53-43-0；注射用大豆油由九三集团哈尔滨众和商贸有限公司提供，批号GB535；甲状腺素片：由尖峰药业有限公司提供，批号1500301；利血平片：由亚宝药业集团股份有限公司提供，批号T15D046；达英-35：由拜耳医药保健有限公司广州分公司提供，批号249A2；ELISA试剂盒购自北京永辉生物科技有限公司，产品编号kt40230。

1.3 主要仪器 OLYMPUS-BX51双目显微镜，日本OLYMPUS公司；DNM-9620酶标仪，北京普朗新技术有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 分组与造模 ICR小鼠54只随机分为空白组、PCOS肾阴虚型模型组、加味蒌石汤高、中、低剂量组、达英-35组，每组9只。空白组每日予颈背部皮下注射注射用大豆油0.1mL，连续40天；其余各组予颈背部皮下注射9mg/100g DHEA油溶液0.1mL，1天1次，连续40天，制备PCOS动物模型。注药第31天，空白组加用等体积生理盐水0.2mL灌胃，1天1次，连续10天，其余组参照《中药药理实验方法学》[4]中小白鼠阴虚证造模方法，即“甲状腺素加利血平”法，加用甲状腺素150mg/kg和利血平1mg/kg体质量灌胃，1天1次，连续10天，制备肾阴虚型动物模型。

1.4.2 药物干预 在造模同时加味蒌石汤高、中、低组分别予浓度为2.0g/mL、1.0g/mL、0.5g/mL中药煎液0.2mL/10g灌胃，1天1次，达英-35组剂量为0.3mg/kg，配制成蒸馏水混悬液，按0.2mL/10g灌服，1天1次。空白组、模型组不干预。

表1 各组小鼠体质量、卵巢质量及卵巢指数比较（±s）

表1 各组小鼠体质量、卵巢质量及卵巢指数比较（±s）

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与中药低剂量组比较，▲P<0.05

组别空白组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组达英-35组例数999999实验前体质量（g）18.03±0.4918.16±0.8118.09±0.7518.15±0.8918.29±0.8718.03±0.84实验后体质量（g）28.36±0.7725.96±0.88*28.25±0.55△▲27.66±1.21△▲26.71±0.7428.08±0.50△▲卵巢质量（mg）28.91±9.1831.19±1.11*28.26±0.93△▲28.95±1.35△▲30.12±2.0228.96±1.05△▲卵巢指数1.09±0.321.20±0.56*1.04±0.43△▲1.08±0.59△▲1.13±0.601.07±0.36△▲

表2 各组小鼠血清性激素水平比较（±s）

表2 各组小鼠血清性激素水平比较（±s）

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01，△P<0.05；与中药低剂量组比较，▲P<0.05；T：血清睾酮；E2：雌二醇；FSH：促卵泡刺激素；LH：黄体生成素

组别空白组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组达英-35组例数999999E2（ng/L）47.25±1.8931.99±4.07**45.17±1.52△△▲41.12±3.53△△▲36.28±0.40△44.65±1.45△△▲T（nmol/L）134.36±2.30146.30±4.04**136.45±2.42△△▲138.32±2.61△△▲142.80±1.08△137.29±2.42△△▲LH（ng/L）1409.02±47.881772.66±122.37**1472.51±54.28△△▲1518.69±21.67△△▲1671.28±41.55△1460.61±44.31△△▲FSH（IU/L）8.16±0.287.39±0.20**7.97±0.08△△▲7.55±0.14△△▲7.46±0.14△7.70±0.16△△▲

1.4.3 标本采集 末次给药后，禁食12h（20：00—次日8：00），眼球摘除取血，分离血清置于-80℃冰箱中储存待测。颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取出卵巢，常规称重。

1.4.4 观察指标及检测 （1）小鼠一般情况及用药前后体质量；（2）卵巢湿重采用电子精密天平测量，计算卵巢指数（卵巢指数=卵巢湿重（mg）/体质量（g）×100%）[3]；（3）Elisa 法测定血清性激素 [血清睾酮（T）、雌二醇（E2）、促卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）]、FS、ACT、环磷酸腺苷（cAMP）及环磷酸鸟苷（cGMP）含量，均严格按照试剂盒说明书操作。

1.4.5 统计学方法 采用IBM SPSS Statistics17.0系统软件对所得结果进行处理，所有计量资料用均数±标准差（±s） 表示，采用单因素方差分析（oneway ANOVA），组间两两比较用LSD检验，均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 各组小鼠一般情况 与空白组比较，实验过程中模型组小鼠逐渐出现不安定、多动、体毛稀疏、饮食减少、腹泻、体质量下降。各治疗组小鼠体质量下降较少，特别消瘦的小鼠较少，比较安静，肾阴虚表现较轻。

2.2 各组小鼠体质量、卵巢质量及卵巢指数比较模型组实验后小鼠体质量低于空白组及各治疗组，小鼠卵巢质量、卵巢指数高于空白组及用药组，除中药低剂量组外，其余各组差异有统计学意义（P<0.05）。中药高、中剂量组及达英-35组小鼠体质量高于中药低剂量组，卵巢质量、卵巢指数低于中药低剂量组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.3 各组小鼠血清性激素水平比较 与空白组比较，模型组小鼠血清T、LH水平均升高，E2、FSH水平均降低，差异均有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，用药组T、LH水平均降低，E2、FSH水平均升高，差异均有统计意义（P<0.05或P<0.01），与中药低剂量组比较，中药高、中剂量组及达英-35组血清T、LH降低，E2、FSH升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.4 各组小鼠血清FS、ACT含量及cAMP/cGMP比较 与空白组比较，模型组FS含量及cAMP/cGMP升高，ACT含量下降，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。与模型组比较，各治疗组 FS、cAMP/cGMP下降，ACT含量升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），见表 3。

3 讨 论

目前越来越多的研究证实PCOS优势卵泡选择受阻的主要原因是卵巢局部自分泌、旁分泌调控异常。ACT、FS都是卵巢局部调控因子，研究[5]发现，ACT通过以下旁/自分泌作用影响了FSH分泌：（1）直接刺激垂体前叶细胞的促性腺激素的合成与分泌；（2）上调垂体细胞促性腺激素释放激素（GnRH）受体的表达，从而促进了GnRH调节下的促性腺激素的合成与分泌；（3）促进下丘脑神经元GnRH的释放。FSH能促使窦前卵泡及窦状卵泡的颗粒细胞增殖与分化，分泌卵泡液，以促进卵细胞的生长发育、成熟。FS是ACT的结合蛋白，以＞2：1的结合率与激活素A（ACTA）的不可逆结合，通过自分泌、旁分泌作用，抑制颗粒细胞芳香化酶的活性，抑制FSH的合成及分泌，对抗ACT对卵泡的作用，从而阻碍了优势卵泡的发育和选择[6]。

表3 各组小鼠血清卵泡抑素（FS）、激活素（ACT）含量及环磷酸腺苷/环磷酸鸟苷（cAMP/cGMP）比较（±s）

表3 各组小鼠血清卵泡抑素（FS）、激活素（ACT）含量及环磷酸腺苷/环磷酸鸟苷（cAMP/cGMP）比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；

组别空白组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组达英组-35例数999999FS（ng/L）34.59±2.5245.07±5.63**36.27±3.05△△38.33±2.47△△39.27±4.09△△36.64±2.55△△ACT（ng/mL）6.87±0.876.12±0.63*6.96±0.60△6.90±0.81△6.86±0.48△7.14±0.73△△cAMP/cGMP 1.28±0.151.85±0.37**1.36±0.10△△1.48±0.11△△1.67±0.08△△1.42±0.11△△

cAMP、cGMP是细胞功能的重要调节物质，可能是中医阴阳理论的基础[7]，cAMP与cGMP是生命活动过程中重要的调节物质，具有相互拮抗，相互制约的生物学效应，是对生物细胞具有双向调节的一对拮抗物。研究[8]表明，中医阴虚证cAMP有升高趋势，cGMP有下降趋势，cAMP/cGMP比值升高，这一结果为不少后来研究者所重复。

根据多囊卵巢综合征（PCOS）临床表现当属中医“月经病”、“不孕”、“癥瘕”等范畴。《医学正传》月经篇中对“肾阴虚”的相关理论早有记载，论曰：“月经全借肾水施化，肾水既乏，则经水日以干涸，以致或先或后，淋沥无时。若不早治，渐而至于闭塞不通，……”傅萍教授认为PCOS肾阴虚证型系思虑过度，扰乱心神，三更入寐，煎熬真阴，导致阴虚血亏，日久化火，更伤阴血，冲任气血渐涸，涩少不通，而致月经稀少，甚至闭经、不孕等症。加味蒌石汤由石斛、熟地、当归各12g，瓜蒌仁 20g，天麦冬各 10g，玉竹、丹参各15g，菟丝子24g组成。方中瓜蒌仁甘寒润燥，宽胸利气，石斛甘淡微寒，益胃生津，滋阴除热，共奏宽胸润肠，利气和胃之效，配伍以熟地、玉竹滋补肾阴，另加天冬、麦冬滋阴增液，菟丝子、当归、丹参益肾养血、活血调冲。全方以滋阴清热，补肾填精之力，使冲任得以调复，胞宫按时满盈，则月事自调，育子有望。本方重用滋阴养血类药物，胞宫得养，卵巢功能逐步改善，从而促进卵泡发育。

本实验经DHEA联合甲状腺素、利血平造模后，模型组小鼠 cAMP/cGMP 升高（P＜0.01），不安定、多动、毛发稀疏、体质量减轻，呈现肾阴虚状态，而加味蒌石汤预防治疗后cAMP/cGMP降低（P＜0.01），小鼠体质量升高，多动等肾阴虚症状好转。中药组较模型组血清性激素改善，且中、高剂量组优于低剂量组（P＜0.05），LH、T、FS 下降，E2、FSH、ACT 升高（P＜0.05，P＜0.01）。猜测加味蒌石汤可能通过降低FS水平，提高ACT水平，降低雄激素的产生，促进垂体分泌FSH，从而达到促进卵泡发育作用且呈剂量依赖性。

［1］ D o n a d e nF X，G i n t h e rO L.F o l l i c u l a rw a v e sa n dc i r c u l a t i n g concentrations of gonadotrophins inhibin and oestradiol during the anovulatoryseason in males［J］.Reproduction，2002，124（6）：875-885.

［2］ I r f a nY a v a s o g l u，M e r tK u c u k，A d i lC o s k u n，e ta l.P o l y c y s t i c Ovary Syndrome and Prolactinoma Association［J］.Inter Med，2009，48（8）：611-613.

［3］韩延华，胡国华.妇科名家诊治多囊卵巢综合征临证经验［M］.北京：人民卫生出版社 2014：527.

［4］李仪奎.中药药理实验方法学［M］.上海：上海科学技术出版社，1991：272.

［5］G r e g o r y S J，K a i s e r U B.R e g u l a t i o no f g o n a d o t r o p i n s b y i n h i bin and activin［J］.Semin Reprod Med，2004，22（3）：253-267.

［6］D e w a i l l y D.P h y s i o p a t h o l o g y o f p o l y c y s t i c o v a r y s y n d r o m e［J］.Ann Endocrinol，1999，60（2）：123-130

［7］陈可冀.环核苷酸双向调节和中医阴阳学说［J］.国外医学.中医中药分册，1978，创刊号：11-14．

［8］李南夷.慢性心衰患者血浆心钠素、环核苷酸水平与虚实证候关系的探讨［J］．中国中医药科技，2004，11（4）：196-197．