Azo功能化Fe3O4磁性纳米载体的载药条件优化及其表征

师洪鹏

(天津市北辰中医医院，天津 300400)

传统化疗药物在治疗中存在很多缺陷，利用纳米载药系统将药物输送至病变部位，可有效克服这些缺陷[1]。磁性Fe3O4纳米粒子[2]是一种特殊的铁磁性物质,具有无毒、磁导向性良好和优异的生物相容性等优势，在医药领域将磁性物质作为载体，与药物和高分子材料结合制成磁性药物制剂的研究一直是当前药物新型制剂最活跃的领域之一[3]。所谓偶氮化合物,是指含有-N=N-键的化合物,偶氮基团是一种具有光学活性的基团,在热和光的作用下可以进行反式-顺式(trans-cis)或者顺式-反式(cis-trans)可逆反应,用不同波长λ1和λ2(λ1>λ2)的光束对偶氮化合物进行照射,可以使其在顺式和反式之间进行可逆的转变,从而导致其吸收特性发生变化[4]。通过对载体的功能化，使得在一定温度下偶氮双键发生断裂，从而达到药物释放的目的。

1 仪器与试药

电子天平(德国 Sartorius公司)；H66025型超声清洗机(无锡市超声电子设备有限公司)；XW-80A 旋涡混合仪(上海楚定分析仪器有限公司)；UV-7504型紫外-可见分光光度计(上海新茂仪器有限公司)；UV-2450型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；SF88-DHG-9075AD-电热鼓风干燥箱[西化仪(北京)科技有限公司]；XW-80A 旋涡混合仪(上海楚定分析仪器有限公司)；79-1磁力加热搅拌器(武汉格莱莫检测设备有限公司)；JJ-1增力电动搅拌器(江苏金坛市宏华仪器厂)。六水合氯化铁，柠檬酸三钠二水合物，三水合乙酸钠，无水乙二胺，二水合磷酸二氢钠，十二水合磷酸氢二钠，无水乙醇，乙二醇，4,4’-偶氮(4-氰基戊酸)，N-羟基丁二酰亚胺，盐酸阿霉素。

2 方法

2.1Azo功能化的Fe3O4磁性纳米载体的制备

2.1.1溶剂热法制备亲水性磁性纳米Fe3O4取FeCl3·6H2O 1.35 g、柠檬酸三钠二水合物0.40 g溶于70 ml乙二醇，超声溶解，搅拌加入3.84 g NaAc·3H2O，在磁力搅拌器上强烈搅拌30 min至溶解，将混合物密封在高压釜中在200 ℃下加热12 h，冷却至室温，黑色产物即为亲水性的磁性纳米Fe3O4，先后用乙醇和去离子水清洗多次，最后用去离子水配制成10 mg/ml分散液。

2.1.2Fe3O4-乙二胺纳米粒制备 取5 mg乙二胺、0.1 g碳二亚胺(EDC)、20 mg “2.1.1”项中制备的Fe3O4，用pH 7.0的PBS(50 mmol/L)溶液定容至40 ml，室温下超声30 min后，磁性分离Fe3O4-乙二胺纳米粒，然后用PBS溶液洗涤数遍以除去未反应的乙二胺。所得的Fe3O4-乙二胺纳米粒用去离子水配制成10 mg/ml分散液。

2.1.3Fe3O4-乙二胺-Azo纳米粒制备 将0.1 g 4,4’-偶氮(4-氰基戊酸，Azo)分散于二甲亚砜(DMSO)，加入0.08 g碳二亚胺(EDC)、0.04 g N-羟基丁二酰亚胺(NHS)混合均匀，再将“2.1.2”项下制备的20 mg Fe3O4-乙二胺纳米粒溶于DMSO后加入上述溶液，DMSO定容至40 ml,然后电动搅拌1 h。最后磁性分离Fe3O4-乙二胺-Azo，DMSO洗涤数遍后，将Fe3O4-乙二胺-Azo用去超纯水配制成10 mg/ml分散液。

2.2载药量和包封率的测定

2.2.1阿霉素标准曲线的绘制 精密称取适量的阿霉素，配制浓度分别为10、20、30、40、50和60 μg/ml的阿霉素标准溶液，在紫外分光光度计下测480 nm的吸收值。以浓度(C，μg/ml)为横坐标，480 nm吸光度(A)为纵坐标，进行线性回归，得到阿霉素的线性回归方程为A=0.019 2C+0.001 9 (r2=0.999 8)。结果表明，在10～60 μg/ml范围内，药物吸光度A与药物浓度C的线性关系良好。

2.2.2载药试验 取适量阿霉素溶液、碳二亚胺(EDC)0.05 g、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)0.05 g，加入2.5 mg所制备的Fe3O4-乙二胺-Azo水溶液中，用超纯水定容至10 ml，避光涡旋振荡25 min，磁性分离，收集上清，在紫外分光光度计下测480 nm波长处的吸光度。根据加入的阿霉素和上清中阿霉素的含量，计算载药量(drug loading，DL)和包封率(entrapment efficiency, EE)。载药量(DL)=(Wt-Wd)/Wp×100%；包封率(EE)=(Wt-Wd)/Wt×100%。其中，Wt和Wd分别为投入阿霉素的总质量和上清中的游离阿霉素质量，Wp为磁粒的质量。

2.2.3载阿霉素载体在PBS缓冲液中的稳定性 为研究载阿霉素载体在PBS缓冲液中的稳定性，将适量载阿霉素载体溶解到PBS缓冲液中，对溶液进行紫外全波长扫描，室温下避光密封保存6 h后，再次进行紫外全波长扫描。

3 结果

3.1载阿霉素载体的表征 游离阿霉素和载阿霉素载体的曲线在480 nm处均有一个峰。见图1。

图1 游离阿霉素、Fe3O4、载体和

3.2载药条件优化

3.2.1不同药物浓度对载药量的影响 取一定量的阿霉素溶液(500 μg/ml)、碳二亚胺(EDC)0.05 g、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)0.05 g，加入2.5 mg所制备的Fe3O4-乙二胺-Azo水溶液中，用超纯水定容至10 ml，溶液中阿霉素浓度分别为25、50、75、100、125和150 μg/ml，避光涡旋振荡25 min，磁性分离，收集上清，在紫外分光光度计下测480 nm波长处的吸光度，分别计算载药量。结果见图2。从图2可以看出，随着阿霉素浓度的增大，载药量增大，阿霉素浓度从25 μg/ml到100 μg/ml载药量明显增大。150 μg/ml与125 μg/ml相比，载药量几乎不再增大，考虑到成本等因素，故选择阿霉素浓度150 μg/ml。

图2 3不同药物浓度对载药量的影响

3.2.2不同投料比对载药量和包封率的影响 取3 ml阿霉素溶液(500 μg/ml)、碳二亚胺(EDC)0.05 g、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)0.05 g，分别加入2.5、5、7.5、10、12.5和15 mg所制备的Fe3O4-乙二胺-Azo水溶液中，用超纯水定容至10 ml，避光涡旋振荡25 min，磁性分离，收集上清，在紫外分光光度计下测480 nm波长处的吸收值，分别计算载药量及包封率。见图3和图4。随着投料比的增加，包封率不断减小，但载药量呈下降趋势，当投料比为150 μg/mg时载药量大幅度下降，故选择投料比150 μg/mg最佳。

图3 载阿霉素载体包封率与载体投量的关系

图4 载阿霉素载体载药量与载体投量的关系

3.2.3最佳载药时间确定 取6 ml阿霉素溶液(500 μg/ml)、碳二亚胺(EDC)0.1 g、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)0.1 g，加入20 mg所制备的Fe3O4-乙二胺-Azo水溶液中，用超纯水定容至20 ml ，避光涡旋振荡，每2 min取样1 ml，磁性分离，收集上清，在紫外分光光度计下测480 nm波长处的吸收值，分别计算载药量。结果见图5。随着载药时间的增长，载药量增大，提取时间从2 min增长到20 min时，载药量明显增大；载药时间继续增长时，载药量持平，因此选择载药时间在20 min。

3.3载阿霉素载体在PBS缓冲液中的稳定性 取适量载阿霉素载体溶解到PBS缓冲液中，对溶液进行紫外全波长扫描，室温下避光密封保存6 h后，再次进行紫外全波长扫描，结果见图6。从图6可以看到，室温下放置6 h后，载阿霉素载体的紫外全波长有些许的偏移，由此可见，载阿霉素载体在PBS缓冲液中是比较稳定的。

图5 载阿霉素载体载药量与载药时间的关系

图6 载阿霉素载体在PBS中的紫外全波长图谱

4 讨论

本试验通过溶剂热法[5]制备的纳米粒子发育完整，磁性较好，粒度分布均匀。与传统路线相比，反应在有机溶剂中进行，有效抑制产物氧化，防止空气中氧污染，大大提高产物纯度。制备了Azo功能化的Fe3O4磁性纳米载体，该纳米载体具有良好的光热性质。通过对其载药条件进行优化，确定最佳载药条件，并通过在PBS缓冲液中的稳定性试验，确认此载体的可应用性，在癌症治疗中很有前景。

1 刘英华. 两亲性纳米载药系统的制备与性能研究[D]. 山东:中国海洋大学,2014：1-2

2 严微，郭娇娇，向晨阳，等.磁性四氧化三铁纳米粒子在医学诊疗领域的研究[J].湖北大学学报,2017,39(3):318-319

3 常娟娟. Fe3O4磁性纳米复合物的制备及载药性能研究[D]. 山西:山西医科大学, 2016：1-3

4 王玉昌. 新型偶氮化合物的合成及表征[D].吉林:吉林大学，2010：1-2

5 张杰，胡登华. 磁性纳米Fe3O4粒子的制备与应用[J].武汉工程大学学报,2011,33(10):4-5