凋亡细胞的清除及组织稳态维持的研究进展

叶庆元 刘世宇 金岩

人体内每天有6×1010个细胞被更新，其中大部分细胞的死亡是属于基因控制的程序性死亡[1]。凋亡是细胞程序性死亡的一种方式，在细胞凋亡过程中，常伴有染色质固缩、细胞核裂解、细胞收缩和出芽小体形成等形态学的变化。研究发现，细胞凋亡在生物的生长发育、自体更新和组织再生过程中起到了重要作用[2]。变性或衰老的细胞凋亡以及这些凋亡的细胞被巨噬细胞吞噬清除的过程对维持机体内环境的稳态具有重要意义。

巨噬细胞来源于骨髓中的单核细胞，是机体固有免疫的重要组成成分，对清除机体内变性、凋亡的细胞，维持内环境稳态有重要作用。在组织器官受损后的炎症反应与修复的过程中，巨噬细胞受到细菌产生的内毒素或淋巴细胞分泌的细胞因子的刺激，向两种不同的方向极化。M1方向极化（又称经典途径活化）的巨噬细胞具有强烈的介导炎症发生、促进血管化和抵抗病原体损害的作用。在组织修复再生的早期阶段，组织原位的巨噬细胞和从骨髓迁移而来的巨噬细胞通常向M1方向极化，促进局部炎症的发生与免疫细胞的迁移、聚集，并加速血管的形成，从而清除入侵病原体[3]。M2方向极化（又称替代途径活化）的巨噬细胞则可以抑制炎症，促进组织的修复与再生。在组织修复再生的后期，受损组织局部常表现为M2方向极化的巨噬细胞聚集，其具有分泌抑制炎症的细胞因子、抑制免疫细胞活化，从而减轻受损组织的继发损害，达到修复组织缺损的目的[4]。巨噬细胞这两种极化状态的转换以及其调控机制一直是研究热点。

本文主要从凋亡的信号通路、巨噬细胞的极化特点以及凋亡细胞与巨噬细胞的相互作用这3个方面对近期研究进行综述。

一、凋亡的信号通路

（一）内源性凋亡途径

内源性凋亡途径的启动与线粒体存在着密不可分的关系。当细胞受到不利于其生存的理化因素刺激时，线粒体双层膜的通透性发生改变，释放出细胞色素c并与存在于溶质中的凋亡蛋白酶活化因子1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）相结合，继而改变了Apaf-1的构象，使其可以结合ATP或dATP。细胞色素c、Apaf-1、ATP/dATP形成的多聚体募集了caspase-9的前体蛋白，这一复合体裂解和激活了下游的caspase途径，从而启动了细胞的凋亡[5]。抑癌基因Bcl-2家族所编码的蛋白（Bcl-XL，Bcl-2，Bax，Bak等）对调控线粒体双层膜的通透性和细胞色素c的释放具有重要作用[6]。当细胞发生凋亡时，原本存在于细胞质的Bcl- XL、Bax等蛋白从胞质中转移到线粒体膜上，并在线粒体膜上形成微孔，介导了细胞凋亡的发生[7]。此外，凋亡诱导因子AIF、核酸内切酶G、凋亡抑制剂相关蛋白Smac、高温应激蛋白A2等都对内源性凋亡途径起到重要的调控作用[8]。

（二）外源性凋亡途径

外源性凋亡途径是由死亡受体所介导的一种凋亡形式。死亡受体是属于肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族的一类跨膜蛋白，其胞外部分富含相似的半胱氨酸序列，也被称为“死亡结构域”[9]。以最经典的死亡受体Fas为例，死亡信号FasL与其受体Fas介导了外源性凋亡途径的启动过程，对清除衰老细胞、病原微生物感染的细胞和肿瘤细胞等具有重要的作用。FasL常表达于激活的T细胞与NK细胞表面，当FasL与细胞膜表面的受体Fas结合后，会诱导Fas的三聚体化[10]。随后，胞质内的具有死亡结构域的Fas相关蛋白（Fas-associated DD containing protein，FADD）结合到三聚体化Fas 的胞内死亡结构域上，形成死亡诱导信号复合物（death-inducing signaling complex，DISC）[11]。DISC募集并激活caspase8，激活的caspase8裂解caspase3的前体，激活caspase3启动了外源性凋亡的级联激活序列[12]。在另一方面，外源性凋亡途径可以与内源性凋亡途径发生相互联系。激活的caspase8可以裂解细胞质中的Bid（一种具有BH2结构域的Bcl-2家族蛋白），继而激活线粒体内蛋白的释放，启动内源性凋亡过程[13]。

（三）内质网相关的凋亡途径

内质网是真核细胞中重要的细胞器，与蛋白质、脂质的合成与代谢有着重要联系，并起到调节细胞内Ca2+稳态的作用[14]。当细胞处于缺氧、糖剥夺和氧化应激的环境时，错误折叠的蛋白质聚集于内质网的管腔中，通过内质网跨膜蛋白肌醇酶1α、蛋白激酶样内质网激酶和转录激活因子6使细胞发生未折叠蛋白应答。未折叠蛋白应答主要是为了清除内质网中未折叠或错误折叠的蛋白质，但当这些蛋白质超出了内质网清除的能力后，未折叠蛋白应答信号通过调节Bcl-2家族蛋白和内质网膜对钙离子的通透性，继而通过内质网与线粒体的相互作用，诱导了细胞凋亡的发生[15]。

二、巨噬细胞的极化及其作用

长久以来，人们认为聚集在受损组织周围的巨噬细胞仅来源于被募集骨髓中的单核细胞[16]。近期研究发现，胚胎时期有一部分骨髓来源的单核细胞通过血流迁移到全身各器官组织中，成为独立存在的、在组织中定居的巨噬细胞，如存在于皮肤中的朗格汉斯细胞、存在于肝脏中的枯否细胞等[17]。这两种来源的巨噬细胞通过不同的途径活化后，对局部受损组织器官的修复有重要作用。

（一）M1方向极化的巨噬细胞

当组织器官受到创伤、感染等刺激，发生炎症反应时，往往激活组织中原位的巨噬细胞和被募集的巨噬细胞向M1方向极化，通过其促进炎症发生和促进血管化的作用从而抵抗病原体的侵害。通常认为巨噬细胞向M1极化有两种途径。一种是病原微生物释放的内毒素（LPS）与机体细胞被破坏释放出的隐蔽抗原[18]（例如DNA等），分别通过跨膜的TLR（toll-like receptors）中的 TLR4和 TLR3，由 NF-κB 通路、AP-1通路上调了M1巨噬细胞相关分子iNOS、IL-6和TNFα的表达[19]。另一种途径是免疫活性细胞分泌的IFN-γ通过巨噬细胞表面的受体IFNGR激活了STAT1通路，上调了炎症相关蛋白的表达[20]。最近有研究发现，LPS可以通过肿瘤坏死因子相关因子6（TRAF6）直接激活巨噬细胞的STAT1通路，促进炎症发生[21]。

（二）M2方向极化的巨噬细胞

在机体受到蠕虫感染或是发生过敏反应时，常会激活Ⅱ型免疫反应的发生[22-23]。在Ⅱ型免疫反应中，辅助性T细胞（Th）分泌的IL-4与IL-13等细胞因子与巨噬细胞表面的受体IL-4Rα与IL-13Rα结合，磷酸化了酪氨酸激酶Jak1和Tyk2，通过STAT6通路启动了巨噬细胞的替代激活途径，上调了M2相关分子如Arg1、Ym1和Yizz1等分子的表达[24]。研究发现，M2方向极化的巨噬细胞可以通过分泌IL-10、TGFβ1等因子，抑制了局部的炎症反应，从而促进受损组织器官的修复再生[25]。

三、巨噬细胞与凋亡细胞的相互作用

成年哺乳动物在受到创伤后，其组织器官的修复能力往往受到限制。较小的、清洁的伤口可以通过Ⅰ期愈合完全修复，而遭受到感染的较大伤口只能通过Ⅱ期愈合修复，并常伴有较为强烈的炎症反应，最终缺损被瘢痕组织取代[26]。与人类不同的是，蝾螈等动物在其组织器官受损后仍具有极强的再生能力，其受到损伤的肢体往往可以完全再生[27-29]。研究发现，这些动物受到创伤后，在其缺损组织局部的早期炎症反应和后期再生过程中，细胞凋亡和巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用具有重要意义[27,30]。

（一）巨噬细胞对凋亡细胞的识别与吞噬

巨噬细胞被认为是多细胞生物体内发挥吞噬功能的主要细胞，其在清除凋亡、变性和衰老的细胞与侵害机体的有害微生物中起到重要作用。近期研究认为，巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用分为2个阶段，第1阶段是对凋亡的目标细胞的识别与黏附，第2阶段是对黏附于其表面上的凋亡细胞的摄取[31]。磷脂酰丝氨酸是巨噬细胞识别凋亡细胞的主要分子。磷脂酰丝氨酸一般位于正常细胞的磷脂双分子层的内侧面，而在细胞启动凋亡过程后会暴露于细胞膜表面，巨噬细胞可以通过表面的磷脂酰丝氨酸受体识别黏附凋亡的细胞[32]。随后，Rac1分子的激活介导了肌动蛋白的聚合，形成“吞噬杯”样结构，启动了巨噬细胞对其所黏附凋亡细胞的摄取过程[33]。

研究发现，巨噬细胞对凋亡细胞的摄取通常是抑制炎症、促进再生的过程[34]。在蝾螈等动物断肢再生的初期阶段，巨噬细胞在缺损组织周围被聚集，并在高水平表达的抗炎因子（IL-4、IL-13）的刺激下，吞噬坏死或凋亡的细胞，从而在局部形成了组织修复的微环境，为再生提供了有利条件[27,35]。另外，在寄生虫感染所造成的肺损伤中，炎症初期被募集的中性粒细胞在凋亡后，凋亡的残余物通过其表面的磷脂酰丝氨酸激活了IL-4 / IL-13刺激的巨噬细胞，上调了巨噬细胞中抗炎基因的表达，促进了损伤肺组织的修复[36]。令人倍感惊讶的是，巨噬细胞不仅可以“被动”的识别衰老变性细胞上特定的受体，还可以“主动”分泌一些蛋白去标记衰老变性的细胞。近期有研究发现，巨噬细胞可以通过产生和分泌钙网蛋白标记衰老的中性粒细胞，之后再由巨噬细胞介导的程序性细胞清除作用清除这些衰老的中性粒细胞，从而维持内环境的稳态[37]。

（二） M1方向极化的巨噬细胞可诱导受损细胞凋亡

在肌肉组织受损的初始阶段，同时有向M1和M2方向极化的巨噬细胞出现在受损组织周围[38]。M1方向极化的巨噬细胞可以通过分泌TNFα，与炎症周围变性细胞包膜表面受体TNFR1结合，通过胞质内去泛素化的受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1与TNFR1相关的死亡结构域蛋白，FADD等相互作用，继而由caspase途径启动了细胞凋亡过程[39]，从而使受损变性的细胞发生程序性死亡。同时，凋亡细胞分泌的趋化因子、溶血磷脂胆碱、磷酸鞘氨醇等分子可以与巨噬细胞胞膜上的相关受体结合，进而促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用[40]。

（三）凋亡细胞可促进巨噬细胞向M2方向极化

M1方向极化的巨噬细胞和M2方向极化的巨噬细胞之间的平衡，对抵抗病原体侵害、抑制纤维化和促进组织器官修复有重要作用[41]。但这两种不同方向极化的巨噬细胞是否可以相互转化，以及如何转化的机制一直是困扰学界已久的问题。近期有研究发现，凋亡细胞与巨噬细胞的相互作用可以促进巨噬细胞向M2方向极化，对炎症后期的组织修复再生有重要意义。被吞噬的凋亡细胞通过ATP激活的蛋白酶α1，促使了已经向M1方向极化的巨噬细胞重新转向M2方向极化，从而抑制了组织周围的炎症反应，启动了修复再生的过程[30]。另一方面，IL-4/IL-13刺激的巨噬细胞可以通过与中性粒细胞的相互作用，促进心肌梗死后的心肌修复与重建[42]。再者，在炎症反应过程中，中性粒细胞吞噬坏死变性的细胞后往往发生凋亡[43]，并且凋亡后产生的细胞残片往往被巨噬细胞所吞噬[44]。有研究指出，IL-4/IL-13刺激的巨噬细胞可以识别凋亡中性粒细胞表面上的磷脂酰丝氨酸，通过磷脂酰丝氨酸决定的酪氨酸激酶AXL和MERTK，上调了M2相关基因如Retnla、Chil3和Arg1的表达，在组织修复和改建中起到不可或缺的作用[36]。

细胞凋亡和巨噬细胞对凋亡细胞的清除对维持机体内环境稳态具有重要意义。极化的巨噬细胞不仅可以通过分泌细胞因子调控细胞的凋亡过程，并且巨噬细胞与凋亡细胞的相互作用可以增加受损器官的组织修复再生能力。但被吞噬到巨噬细胞内的凋亡细胞残体，是否可以被重新利用，或是通过一些其他机制调控了巨噬细胞的极化方向，从而促进受损组织器官的修复，还有待更加深入的研究。