硫化氢通过调控SIRT1抑制阿霉素诱导的H9c2细胞损伤

哈斯高娃 曹中朝 刘东华

阿霉素（doxorubicin，DOX）是一种高效的化疗药物，广泛应用于临床癌症的治疗[1-2]。但是，这种药物可以引起急性和慢性心脏毒性，包括心动过速、心律失常、低血压、短暂性左心室功能抑制，甚至难治性迟发性心肌病[3-4]。此外，随着DOX剂量的增加，DOX引起的心脏毒性会加重。当DOX积累剂量达到700 mg/m2时，心衰发生率将增加到48%[5]。尽管DOX有强大和有效的功能，但因具明显的副作用，使其应用十分有限。

硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）过去被认为是一种有毒气体，现发现其是除一氧化氮和一氧化碳外的第三种气体信号分子，对心血管系统有多种功能[6]。Huang等[7]报道外源性H2S对高糖诱导的H9c2心肌细胞炎症和毒性具有保护作用。值得注意的是，近年来许多研究发现H2S能够拮抗DOX导致的心肌细胞毒性[8-9]。然而，H2S对抗DOX发挥心肌保护作用的分子机制尚未完全阐明。

本研究首先通过探讨H2S供体NaHS对DOX处理的H9c2细胞活力和氧化应激相关指标ROS、MDA和SOD水平的影响，明确H2S对DOX心肌毒性的保护作用。文献报道，SIRT1具有抗氧化作用[10]。那么，SIRT1是否参与H2S抗DOX心肌毒性作用机制。本研究通过探讨H2S对DOX作用下的H9c2细胞SIRT1蛋白表达的影响以及加入SIRT1抑制剂能否阻断H2S对DOX导致的H9c2细胞毒性的抑制作用，以明确SIRT1对H2S抗DOX心肌毒性的介导作用。

材料与方法

一、实验材料

（一）实验试剂

DMEM培养基购买于美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国GIBCO公司。MTT试剂购买于美国Sigma公司。MDA、SOD检测试剂盒均购买于南京建成生物工程研究所。ROS检测试剂盒来源于上海碧云天生物公司。SIRT1和β-actin抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

二、实验方法

（一）细胞培养

大鼠胚胎心肌细胞H9c2细胞来源于上海中科院细胞库。使用含10%胎牛血清和1%青霉素- 链霉素的DMEM培养基于37℃，5%CO2培养箱中培养细胞。每隔1 ～ 2 d进行细胞传代处理。当细胞汇合度达到80%左右时给予药物处理。探讨H2S对DOX心肌毒性的保护作用的实验分组为：对照组（Control组），5 μmol/L DOX 处理组（A 组），5 μmol/L DOX 和 400 μmol/L NaHS 共同处理组（B 组），400 μmol/L NaHS 单独处理组（C组），5 μmol/L DOX、400 μmol/L NaHS 和 15 μmol/L Sirtinol共同处理组（D 组），15 μmol/L Sirtinol 单独处理组（E组）。探讨SIRT1是否参与H2S抗DOX心肌毒性作用机制的实验分组为：对照组（Control组），5 μmol/L DOX 处 理 组（F 组），5 μmol/L DOX和 400 μmol/L NaHS 共同处理组（G 组），5 μmol/ L DOX、400 μmol/L NaHS 和 15 μmol/L Sirtinol共 同处理组（H 组），15 μmol/L Sirtinol 单独处理组（I组）。

（二）MTT法检测细胞活力

将H9c2细胞以1×104个/孔的种板密度均匀接种到96孔板中。先后加入Sirtinol、H2S和DOX处理细胞。药物处理结束后，加入终浓度为0.5 mg/ ml的MTT溶液。于37 ℃，5% CO2培养箱孵育4 h后，向每孔加入150 μl的DMSO溶解结晶紫。最后，于570 nm波长下，使用酶标仪检测样品吸光值。

（三）MDA、SOD水平测定

将H9c2细胞以4×105个/孔的种板密度均匀接种到6孔板中。药物处理结束后，使用胰酶消化细胞，调整细胞数至1×106个左右。然后，用PBS洗涤2次，1 000×g离心10 min，去掉上清液。将离心后的细胞沉淀进行超声破碎处理，随后重悬细胞裂解液。根据厂家说明书，分别测定MDA和SOD的水平。

（四） DCFH-DA荧光探针法检测ROS水平

收集 1×106～ 2×107个 /ml的细胞，加入终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA。然后，于37℃培养箱内孵育20 min。每隔3 ～ 5 min颠倒混匀一下细胞，使其与探针充分接触。再用无血清培养液洗涤细胞3次，充分去除未结合的DCFH-DA。最后，使用流式细胞仪检测ROS水平。

（五） Western blot法检测蛋白表达水平

药物处理结束后，使用蛋白裂解液提取细胞蛋白。运用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定。然后，配置10%的分离胶，经SDS-PAGE电泳。电泳结束后，进行恒流转膜（湿转法）。用含5%脱脂牛奶的TBST溶液于常温摇床上封闭PVDF膜。封闭2 h后，使用一抗稀释液于4℃摇床上孵育PVDF膜并过夜。TBST洗膜5次，每次5 min。加入二抗稀释液于常温摇床上孵育PVDF膜2 h。向PVDF膜上加入显影液，使用凝胶成像系统进行成像。最后，使用Image J软件对蛋白条带进行分析。

三、统计学分析方法

采用SPSS 18.0统计软件，细胞活力、ROS、MDA以及SOD水平和蛋白条带灰度值均用表示，多组之间的细胞活力、ROS、MDA以及SOD水平和蛋白条带灰度值的比较采用单因素方差分析法。以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、H2S可抑制DOX诱导的H9c2细胞活力降低和氧化应激

结果如表 1 所示，NaHS（400 μmol/L，30 min）预处理可减轻DOX导致的H9c2细胞活力下降，差异具有统计学意义（F= 134.9，P＜ 0.001）。此外，NaHS预处理可抑制DOX引起的H9c2细胞ROS、MDA水平的增加以及SOD含量的降低，差异具有统计学意义（F= 83.26，P＜ 0.001；F=271.4,P＜0.001；F=127.0,P＜ 0.001）。

二、H2S可抑制DOX对H9c2细胞SIRT1蛋白的下调作用

结果如图1a所示，F组处理 6、12、24 h后的H9c2细胞SIRT1蛋白表达水平分别是（0.45±0.03）、（0.27±0.02）、（0.25±0.03）， 较Control组（1.00±0.00）降低，差异具有统计学意义（F= 611.1，P＜ 0.001）。结果如图 1b所示，NaHS（400 μmol/L，30 min）预处理 H9c2细胞能抑制DOX引起的SIRT1蛋白表达的下调：Control组、F组、G组、H组的SIRT1蛋白表达水平分别1.00±0.00、0.31±0.03、0.60±0.04、1.09±0.09，差异具有统计学意义（F= 123.4，P＜ 0.001）。

三、SIRT1抑制剂可阻断H2S对DOX导致的H9c2细胞活力降低和氧化应激的拮抗作用

结果如表 2所示，15 μmol/L Sirtinol组（SIRT1抑制剂）预处理30 min能减弱H2S对DOX诱导的H9c2细胞活力降低的抑制作用，差异具有统计学意义（F= 238.2，P＜ 0.001）。Sirtinol（15 μmol/ L，30 min）组预处理H9c2细胞后，可拮抗H2S对DOX诱导的H9c2细胞ROS和MDA含量增加及SOD和GSH水平降低的抑制作用，差异具有统计学意义（F= 112.0，P＜ 0.001；F= 93.73，P＜ 0.001；F= 84.92，P＜ 0.001）。

图1 H2S和DOX对H9c2细胞SIRT1蛋白表达的影响

表1 H2S对DOX诱导的H9c2细胞活力和氧化应激的影响（± s）

表1 H2S对DOX诱导的H9c2细胞活力和氧化应激的影响（± s）

注：与Control组比较aP ＜ 0.001；与A组比较bP ＜ 0.001

分组 样本量 细胞相对活力OD值（%） ROS相对荧光强度（%） MDA（μmol/g） SOD（U/mg）Control组 3 100.00±0.00 100.00±0.00 34.18±1.56 53.69±1.44 A 组 3 54.58±1.58a 174.90±12.65a 72.65±2.66a 31.80±2.05a B 组 3 85.05±4.31b 126.08±6.25b 44.59±1.92b 48.06±1.56b C 组 3 100.22±4.46 91.86±1.66 32.93±1.56 55.93±1.58 F值 134.9 83.26 271.4 127.0 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 Sirtinol减弱H2S抑制DOX导致的H9c2细胞活力降低和氧化应激（± s）

表2 Sirtinol减弱H2S抑制DOX导致的H9c2细胞活力降低和氧化应激（± s）

注：与 Control组比较 aP ＜ 0.001，与 F 组比较，bP ＜ 0.001，与 G 组比较，cP ＜ 0.001

分组 样本量 细胞相对活力OD值（%） ROS相对荧光强度（%） MDA（μmol/g） SOD（U/mg）Control组 3 100±0.00 100.00±0.00 35.84±2.22 53.03±3.16 F组 3 54.41±1.87a 184.60±11.33a 74.78±5.30a 29.26±0.85a G 组 3 85.37±3.62b 126.50± 7.57b 41.95±3.43b 52.61±2.26b H 组 3 71.11±2.11c 174.70± 5.50c 67.69±1.52c 35.33±1.95c I 组 3 97.53±1.45 98.03± 2.86 37.66±2.49 51.14±1.55 F值 238.20 112.00 93.73 84.92 P值 0.00 0.00 0.00 0.00

讨 论

DOX是应用最广泛和最成功的抗肿瘤药物之一，尽管DOX的临床应用受到累积和剂量依赖性心毒性效应的限制。随着癌症幸存者人数的不断增加，越来越需要制定预防策略和有效的治疗方案，以对抗DOX诱导的心脏毒性，特别是迟发性心肌病。虽然DOX的心脏毒性作用以前已经被研究过，但是这些作用的潜在机制仍有待阐明。越来越多的证据支持这一假设即自由基诱导氧化应激导致心肌细胞凋亡和坏死，是DOX诱导心脏毒性的关键因素[11-12]。

先前的研究结果表明，外源性H2S通过抗氧化效应和抑制炎症反应，对DOX诱导的心脏毒性产生保护作用[13-15]。Guo等[15]人已经证明外源H2S通过抑制H9c2细胞p38 MAPK/NF-κB通路拮抗DOX诱导的炎症和细胞毒性。H2S还通过抑制H9c2细胞内质网应激或抑制H9c2细胞过氧化物酶Ⅲ[9]的表达来降低DOX诱导的心脏毒性。此外，H2S可通过PI3K/Akt/FoxO3a通路保护H9c2心肌细胞免受DOX诱导的细胞毒性作用[8]。Su等[16]人已经证明内源性H2S的降低可能参与了DOX诱导心肌病的发病机制，因为H2S能够降低脂质过氧化，增加抗氧化酶系统的活性，从而抑制氧化应激诱导的损伤。首先，为了探讨H2S对DOX导致的H9c2细胞毒性的影响，使用MTT法检测NaHS（H2S供体）对DOX作用下的H9c2细胞活力，本研究发现H2S对DOX诱导的H9c2细胞活力降低具有保护作用。基于氧化应激是DOX诱导心肌细胞毒性的一个重要机制。于是，本研究进一步探讨了H2S对DOX导致的H9c2细胞氧化应激的影响。研究结果显示H2S对DOX诱导的H9c2细胞氧化应激具有抑制作用。以上发现表明H2S可抑制DOX诱导的H9c2细胞毒性以及氧化应激，这与以往发现H2S具有对抗DOX引起的心肌细胞毒性相一致[13-15]。

Sirtuin-1（SIRT1）是一种高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖性组蛋白脱乙酰酶，在氧化应激、炎症和衰老中起着关键作用[17]。SIRT1对细胞氧化还原状态高度敏感，通过多个细胞靶点的去乙酰化作用来抵消活性氧的影响，从而发挥心脏保护和维持血管功能[18]。Wu等[19]人报道，H2S可通过SIRT1通路保护氧化应激诱导的H9c2心肌细胞凋亡。最近的研究发现，SIRT1介导了H2S对H2O2作用下的新生小鼠心肌细胞的保护作用[20]。以上资料提示SIRT1在H2S的心肌保护作用中发挥重要作用。那么，SIRT1是否在H2S抗DOX诱导的心肌细胞毒性中同样扮演重要作用，需要进一步探讨。于是，采用Western Blot法检测了H9c2细胞SIRT1蛋白表达水平，探讨DOX对H9c2细胞SIRT1蛋白表达的影响。本研究发现DOX可浓度依赖性降低H9c2心肌细胞SIRT1蛋白表达水平。这提示H2S抗DOX心肌毒性作用可能与其调控SIRT1蛋白表达有关。接着，本研究发现NaHS预处理可明显抑制DOX对H9c2细胞SIRT1蛋白的下调作用。以上结果提示SIRT1蛋白可能介导了H2S的抗DOX心肌细胞毒性作用。于是，本研究大胆猜想使用SIRT1抑制剂Sirtinol后，H2S对DOX诱导的H9c2心肌细胞活力降低和氧化应激的拮抗作用是否会被逆转。本研究结果显示，Sirtinol预处理能明显取消H2S对DOX导致的H9c2细胞活力降低的拮抗作用。此外，还发现使用Sirtinol抑制SIRT1可逆转H2S对DOX诱导的H9c2细胞氧化应激即ROS和MDA水平的升高和SOD含量的降低的抑制作用。以上研究发现表明SIRT1对H2S抗DOX的心肌保护作用具有介导效应，这与先前的研究报道相一致[19-20]。

综上所述，本文率先证明H2S可以通过SIRT1抑制DOX诱导的H9c2细胞毒性。这些新发现不仅有助于理解H2S的重要生理作用，也为DOX引起的心肌毒性相关疾病的治疗提供了新的思路。