巨噬细胞浸润在低级别胶质瘤预后预测中的研究

马健行 吴鹏飞 杨伟 廖茂君 易良 许民辉

胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤[1]。胶质瘤可根据WHO组织病理学分级标准分为Ⅰ～Ⅳ级；在成人中以WHOⅡ～Ⅳ级胶质瘤最常见，且肿瘤级别越高，患者预后越差[2]。低级别胶质瘤（low grade glioma，LGG）具有侵袭性生长、放化疗抵抗等恶性生物学特征，并且有向高级别胶质瘤进展的倾向，传统治疗方法包括手术全切肿瘤、术后辅以放疗、化疗在内的综合治疗，患者预后仍不理想。

异柠檬酸脱氢酶1和2（isocitrate dehydrogenase 1 and 2，IDH1 and IDH2）是三羧酸循环中的关键酶，肿瘤细胞中IDH 1/2基因突变使2-羟戊二酸大量堆积[3]，抑制组蛋白和DNA去甲基化酶，诱导组蛋白和DNA超甲基化，通过表观遗传修饰途径诱导细胞分化阻滞[4]。IDH突变绝大部分发生于IDH 1基因，另有不到1%发生在IDH 2基因[5]。研究表明，肿瘤细胞IDH 1/2基因的突变状态是LGG分子分型的重要参考指标，IDH 1/2突变型低级别胶质瘤（IDH 1/2-mu LGG）患者预后好于IDH 1/2野生型低级别胶质瘤（IDH 1/2-wt LGG）患者[6]。

胶质瘤细胞通过分泌多种因子吸引免疫细胞进入肿瘤组织，这些免疫细胞分泌细胞因子和趋化因子，与肿瘤细胞相互作用，形成胶质瘤免疫微环境[7]。肿瘤相关性巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAM）是胶质瘤免疫抑制微环境重要的组成成分[8]，除表达巨噬细胞标记物（CD68、CD11b、IBA1）外，TAM 还具有 CD163、CD204等多种标记物特异表达的特点[7]；胶质瘤细胞分泌趋化因子 CCL2[9]、CCL5[10]、骨膜蛋白（POSTN）[11]、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[12]和神经降压素（Neurotensin）[13]诱导巨噬细胞和TAM浸润，TAM分泌免疫抑制因子如白介素 -10（IL-10）[14]、转化生长因子 -β（TGF-β）[15]，形成肿瘤免疫抑制微环境，促进肿瘤细胞的生长和侵袭。

相关研究提示，胶质瘤细胞IDH 1/2突变状态影响胶质瘤免疫微环境构建[16]，但其对TAM浸润程度和功能状态有何影响以及TAM浸润相关指标在LGG各分子亚型预后预测的价值尚不明确。因此，本研究通过检测胶质瘤石蜡样本和分析癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）中LGG数据，揭示TAM特异标志物、相关趋化因子和免疫抑制因子在IDH 1/2-wt LGG和IDH 1/2-mu LGG中的表达差异，阐明TAM浸润相关指标在IDH 1/2-wt LGG和IDH 1/2-mu LGG患者预后预测中的价值。

材料与方法

一、材料

1.肿瘤石蜡标本：收集2017年1月至2017年10月陆军军医大学第三附属医院神经外科行手术治疗的低级别胶质瘤患者的肿瘤石蜡标本共36例（包括17例IDH 1/2-wt LGG和19例IDH 1/2-mu LGG）。所选病例病理信息完整，患者已签署知情同意书。

2. TCGA数据：本实验所需的529例LGG（包括419例IDH 1/2-mu LGG和110例IDH 1/2-wt LGG）转录组数据、单核苷酸突变数据和临床信息数据下载自TCGA数据库[17]。

3.试剂：小鼠抗人单克隆抗体CD68（kit- 0026）购自福州迈新公司，小鼠抗人单克隆抗体CD163（ZM-0428）、小鼠抗人单克隆抗体CD204（TA802777）购自中杉金桥公司；DAB显色试剂购自福州迈新公司，其余试剂即配即用。

二、实验方法

1.免疫组织化学染色：将上述胶质瘤患者的肿瘤石蜡标本切片置于60 ℃温箱4 h脱蜡、水合，然后封闭内源性过氧化物酶，热抗原修复。用免疫组化笔画圈围住组织，圆圈完整。滴加一抗工作液（CD68、CD163、CD204）盖住组织，然后放入湿盒内4 ℃过夜。12 h后，取出湿盒，37 ℃复温30 min，滴加DAB显色，然后用苏木素复染显色细胞核，脱水，晾干片子后滴加适量中性树胶封片，盖上盖玻片，小心气泡，晾干即可。用非免疫血清代替一抗工作液作为阴性对照。

2.数据处理：免疫组化阳性染色区域的平均光密度值（average optical density，AOD）使用Image Pro Plus 6.0分析；TCGA数据进行标准化处理，将数据格式由FPKM转换为TPM；基因表达水平高低的截断值使用Cut-off Finder[18]计算。

三、统计学分析方法

使用SPSS 25.0统计软件进行统计学处理，各指标表达水平非正态分布，统计方法使用Mann- WhitneyU检验；上述分子表达水平对IDH 1/2-mu LGG和IDH 1/2-wt LGG预后的影响使用COX回归分析进行评价；两组患者生存分析使用Kaplan- Meier法，两组间生存率的比较使用对数秩检验（log-rank test），以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、巨噬细胞和TAM分子标志物表达水平存在差异

TCGA中529例LGG数据分析显示，巨噬细 胞 标 志 物 CD68（Mann-WhitneyU= 19425，P＜0.05）、CD11b（Mann-WhitneyU=15836，P＜0.01）、IBA1（Mann-WhitneyU=17758，P＜0.01）表 达 水 平 在 IDH1/2-wt LGG 中 升 高；TAM 标 志 物 CD163（Mann-WhitneyU=18112，P＜0.01）、CD204（Mann-WhitneyU=12676，P＜0.01）的表达水平也在IDH1/2-wt LGG中升高（图 1，表 1）。

图1 巨噬细胞和TAM标记物在IDH1/2-wt LGG和IDH1/2-mu LGG中的表达水平

二、免疫组化检测TAM在IDH 1/2-wt和IDH 1/2-mu LGG中的浸润程度

免疫组织化学染色显示，IDH 1/2-wt LGG中CD68+细胞、CD163+和CD204+细胞浸润数量高于 IDH 1/2-mu LGG；CD68、CD163、CD204 在IDH 1/2-wt LGG组织中的表达数量和强度均高于IDH 1/2-mu LGG。CD68、CD163、CD204阳 性 染色位于部分细胞浆中，呈棕褐色；IDH 1/2-wt LGG组织切片CD68、CD163、CD204染色强度均较IDH 1/2-mu LGG切片染色深，且IDH 1/2-wt LGG切片中阳性染色细胞的比例也高于IDH 1/2- mu LGG。两组样本阳性染色区域AOD值分析显示，IDH 1/2-wt LGG 中 CD68（Mann-WhitneyU= 51，P＜ 0.01）、CD163（Mann-WhitneyU= 35，P＜ 0.01）、CD204（Mann-WhitneyU= 20，P＜ 0.01）表达水平较 IDH 1/2-mu LGG 均升高（P＜ 0.01）（图 2 ～ 3，表 2）。

表1 Mann-Whitney U检验IDH1/2-wt和IDH1/2-mu LGG中巨噬细胞和TAM标志物表达

表2 Mann-Whitney U检验免疫组化中CD68、CD163和CD204的表达

图2 光学显微镜下观察CD68、CD163和CD204在组织中的表达情况（DAB染色，×400）

图3 CD68、CD163和CD204在肿瘤组织切片中的表达

三、TAM趋化因子和免疫抑制因子表达水平存在差异

TCGA中529例LGG数据分析显示，在IDH 1/2-wt LGG组中TAM趋化因子CCL2（Mann- WhitneyU= 15 841，P＜ 0.01）、CCL5（Mann- WhitneyU= 11 326，P＜ 0.01）、POSTN（Mann- WhitneyU= 8 893，P＜ 0.01）、VEGF-A（Mann- WhitneyU= 14 433，P＜ 0.01）、Neurotensin（Mann- WhitneyU= 15 556，P＜ 0.01）的表达水平均较IDH 1/2-mu LGG升高。同时，TAM产生的免疫抑制因子TGF-β（Mann-WhitneyU= 15 459，P＜ 0.01） 和 IL-10（Mann-WhitneyU= 17 334，P＜ 0.01）的表达水平在IDH 1/2-wt LGG组中也升高（图 4，表 3）。

四、CD163和IL-10的表达水平分别与IDH 1/2-wt和IDH 1/2-mu LGG患者的预后负相关

TCGA数据Kaplan-Meier生存分析显示，CD163表达水平与IDH 1/2-wt LGG患者预后负相 关（P= 0.0125），CD163lowIDH 1/2-wt LGG 组和 CD163highIDH 1/2-wt LGG组的 2年和 5年总生存率分别为69.7%vs45.3%和 40.6%vs18.6%，但该分子表达水平与IDH 1/2-mu LGG患者预后无相关性（P= 0.3926）。IL-10表达水平与IDH 1/2- mu LGG 患者预后负相关（P= 0.0259），IL-10lowIDH 1/2- mu LGG组和 IL- 10highIDH1/2-mu LGG组的5年总生存率分别为75.9%vs50.5%，但该分子表达水平与IDH 1/2-wt LGG患者预后无相关性（P= 0.0721）。（图 5）

讨 论

胶质瘤中的巨噬细胞在不同的信号刺激下，可以激活成两种不同的免疫表型：促进炎症发生的经典活化型巨噬细胞和抑制炎症反应的替代性活化巨噬细胞，肿瘤中巨噬细胞以后者浸润为主，即TAM[19]。TAM与其他细胞共同形成免疫抑制微环境，促进肿瘤生长。本研究发现IDH 1/2-mu LGG中巨噬细胞和TAM浸润数量较IDH 1/2-wt LGG明显减少，且IDH 1/2-mu LGG肿瘤微环境中TAM趋化因子和免疫抑制因子表达水平较IDH 1/2-wt LGG也明显降低。TAM标志物CD163及其分泌的免疫抑制因子IL-10表达水平分别与IDH 1/2-wt LGG和IDH 1/2-mu LGG患者总生存率负相关。

图4 TAM趋化因子、免疫抑制因子在IDH1/2-wt LGG和IDH1/2-mu LGG中的表达水平

表3 Mann-Whitney U检验TAM趋化因子和免疫抑制因子表达

图5 CD163和IL10表达水平对IDH-wt/mu LGG患者总生存期的影响

胶质瘤细胞产生多种趋化因子促进TAM浸润。胶质瘤细胞可以直接分泌CCL2和CCL5，也可以通过分泌Neurotensin与TAM上的NTR3/ sortilin受体结合，刺激TAM合成分泌大量的CCL2和CCL5[13]。CCL2是最重要的招募TAM的趋化因子之一，CCL2与TAM表达的受体CCR2相结合，通过CCL2-CCR2-IL-6信号通路促进新生血管生成、肿瘤细胞增殖和侵袭，CCL2的表达水平与肿瘤病理级别正相关[9]。CCL5与TAM上的受体CCR1/ CCR5结合，通过冗余方式招募TAM[20]。胶质瘤中POSTN表达水平与肿瘤病理级别正相关，与患者的预后负相关。缺氧诱导胶质瘤中POSTN表达上调，引起巨噬细胞大量浸润并促进其向TAM表型转化[21]。在胶质母细胞瘤中，POSTN表达水平与TAM浸润程度正相关，干扰POSTN的表达可以减少TAM的浸润，抑制肿瘤生长，延长载瘤小鼠的生存时间[11]。多项研究表明，TAM分泌大量的VEGF促进肿瘤血管形成，因此，Piao等在胶质母细胞瘤小鼠模型中联合应用贝伐单抗与舒尼替尼，分别阻断VEGF和VEGF受体（VEGFR），抑制肿瘤的血管形成，减少骨髓来源的巨噬细胞浸润，延长载瘤小鼠生存时间[22]。在脉络膜新生血管性疾病模型中，阻滞VEGFR同样可以观察到巨噬细胞浸润的减少[23]。本研究提示，IDH1/2-mu LGG组中TAM趋化因子表达水平低可能是IDH1/2-mu LGG患者预后较好的因素之一。

TAM浸润能够降低LGG总生存率。肿瘤细胞通过分泌TAM趋化因子招募巨噬细胞并促进其向免疫抑制表型TAM转化。TAM除了具有促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的功能外，还可以分泌蛋白聚糖，抗胰蛋白酶，穿透素-3和多种金属蛋白酶降解细胞外基质，促进新生血管生成[24-25]；有研究表明，TAM甚至可以通过分泌喹啉酸，增强胶质瘤对DNA损伤的修复能力，诱导胶质瘤对放化疗耐受[26]。研究发现巨噬细胞和TAM浸润数量与肿瘤的病理恶性程度相关[27]；在胶质母细胞瘤中，短生存期（OS ＜ 36个月）胶质母细胞瘤TAM所占的比例高于长生存期（OS ＞ 36个月）的胶质母细胞瘤[28]。由于IDH 1/2-mu LGG患者具有更好的放化疗敏感性，IDH 1/2-mu LGG患者往往较IDH 1/2- wt LGG患者具有更好的预后。本研究进一步提示，IDH 1/2-mu LGG患者免疫微环境中TAM浸润数量少也可能是该类患者具有较好预后的原因之一。

TAM通过分泌大量免疫抑制因子和免疫细胞间的相互作用形成胶质瘤免疫抑制微环境。TAM同时表达IL-10和IL-10受体，通过自分泌模式维持TAM免疫表型；IL-10的自分泌引起转录因子STAT3磷酸化，诱导TGF-β的转录[7]。研究表明，TGF-β可以引起TAM的标记物CD163、CD204表达上调，促进向巨噬细胞向TAM转化[27]。此外，TGF-β和IL-10还可以降低T细胞和自然杀伤细胞的抗肿瘤能力，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、和迁移[19,29]。本研究表明，在IDH 1/2-mu LGG中，免疫抑制因子IL-10和TGF-β表达水平较IDH1/2- wt LGG降低、免疫抑制状态较弱，降低肿瘤增殖、迁移能力。因此TAM分泌的免疫抑制因子水平较低可能是IDH 1/2-mu LGG预后较好的因素之一。与IDH 1/2-wt LGG相比，IDH 1/2-mu LGG表达的TAM趋化因子减少，肿瘤中巨噬细胞和TAM浸润的数量和TAM产生的免疫抑制因子也减少。因此IDH 1/2-mu LGG患者预后较IDH 1/2-wt LGG好，可能与两者间TAM的浸润数量及免疫抑制状态存在差异相关。IDH 1/2突变的胶质瘤细胞释放TAM趋化因子较少，导致TAM浸润数量减少，总体产生的免疫抑制因子减少，免疫抑制作用减弱，促进肿瘤增殖、迁移和侵袭的功能减低，患者总生存期更长。

已有的研究表明，IDH 1/2突变状态对LGG患者预后的预测优于组织学分级[30]，但临床实践表明IDH突变状态相同的患者对治疗的反应和预后不尽相同，目前尚无可靠指标能够进一步预测IDH 1/2-mu LGG亚型或IDH 1/2-wt LGG亚型的预后。肿瘤石蜡切片免疫组化染色和TCGA数据分析的结果表明，IDH 1/2-wt LGG和IDH 1/2-mu LGG中TAM的浸润数量及免疫抑制程度存在差异，进一步探讨了相关指标对IDH 1/2-wt LGG患者和IDH 1/2-mu LGG患者预后预测的价值，发现CD163highIDH 1/2-wt LGG组和CD163lowIDH 1/2-wt LGG组的2年和5年总生存率以及IL- 10highIDH 1/2-mu LGG组和IL-10lowIDH 1/2-mu LGG组的5年总生存率间存在明显差异。因此，上述结果表明，通过检测CD163和IL-10的表达水平，可以在IDH1/2突变状态的基础上进一步分别预测IDH 1/2-wt LGG患者和IDH 1/2-mu LGG患者的预后。

综上所述，IDH 1/2-wt LGG和IDH 1/2-mu LGG中TAM的浸润数量及免疫抑制状态存在差异，CD163和IL-10表达水平分别具有预测IDH 1/2-wt LGG和IDH 1/2-mu LGG患者预后的价值。后期的研究将尝试把TAM浸润指标的表达水平与患者对放化疗的获益程度结合分析，筛选对患者治疗方案有指导意义的指标，建立LGG患者放化疗敏感性预测模型。