微生物检定法测定乙酰螺旋霉素片含量的不确定度评定

宋玉霞 田妮娜

（1 河西学院，甘肃 张掖 734000；2 兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730000）

乙酰螺旋霉素片是一种广谱抗菌药，可有效抵御由金黄色葡萄球菌、肺炎球菌等引起的感染。目前报道的其含量测定的方法有紫外分光光度法[1]、管碟法（《中国药典》2005年版）以及比浊法[2]等，但是这些方法存在专属性差、测量结果误差大、操作复杂、耗费时间长等缺点，《中国药典》（2015年版）[3]采用微生物检定法测定其含量。

不确定度是一种表征合理赋予被测量值的分散性，与测量结果相关联的参数[4]。微生物测定的不确定度主要考虑的是A类评估，相对而言，B类评估的因素较少[5]。郜振华[6]等对乙酰螺旋霉素片含量测定的不确定度进行评定，但是只对供试品及标准品制备过程，以及微生物鉴定和结果重复性所带来的不确定度进行评定，不确定度分量并不够细化。为了在测量结果的表达和质量评定等方面更为准确，本实验根据JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》对微生物检定法测定乙酰螺旋霉素片含量的不确定度进行了测量和评定，为评价该方法的准确性和可靠性提供依据。

1 材 料

ZY-300IV多功能微生物自动测量分析仪（北京先驱威锋技术开发司），Mettler MS205DU电子天平（梅特勒-托利多），恒温恒湿培养箱（德国HCP153Memmert）。乙酰螺旋霉素标准品（中检院，效价测定用，S对1324 U/mg，批号：130347-201304）。乙酰螺旋霉素片样品（甘肃兰药药业有限公司，批号：20150203，抗生素Ⅱ号培养基（7.8-8.0，批号130916），菌种：枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501）。

2 方 法

2.1 标准品溶液的制备：精密称取乙酰螺旋霉素标准品0.01881 g（W对），置于25 mL的容量瓶中加乙醇8 mL使其溶解，然后用灭菌水稀释并定容至刻度，摇匀，得溶液为996.1776 U/mL。精密吸取2 mL，用磷酸盐缓冲液（pH7.8）稀释至50 mL，摇匀，即得SH；再精密吸取溶液2 mL，用磷酸盐缓冲液（pH 7.8）稀释至100 mL，摇匀，即得SL。

2.2 样品溶液的制备：取乙酰螺旋霉素片20片（W总重：5.1990 g，则W平均：0.2600 g），精密称取细粉0.25984 g（W样），置于100 mL的容量瓶中，加乙醇40 mL使溶解，然后用灭菌水稀释并定容至刻度，摇匀，得溶液为999.3846 U/mL。同法得TH和TL。

2.3 双碟的制备与培养：取平底双碟12套，分别加入加热融化的培养基20 mL，凝固后作为底层。另取加热融化后的培养基适量，放于50 ℃的水浴锅中至恒温， 加入枯草芽孢杆菌菌悬液适量，每一双碟中分别加入5 mL，作为菌层。冷却后，每一双碟中以等距离安置不锈钢小管4个，待用。将上述稀释好的标准品溶液与样品溶液分别滴加于不锈钢小管内，在36 ℃恒温恒湿培养箱中培养16 h。

2.4 抑菌圈直径的测定与效价计算：取出培养好的双碟，用抑菌圈测量仪测量各个抑菌圈的直径， 照生物检定统计法进行可靠性检验与效价计算。D值＝标准品溶液浓度/供试品溶液浓度＝996.1776/999.3846＝0.9968；估计效价At＝100000 U/mg；剂间比：2。

扫描抑菌圈得可靠性检验：直线回归和剂间非常显著（P＜0.01）与偏离平行不显著（P＞0.05），可信限率为4.8%，样品的测定效价（Pt）为98403.6247 U/mg。供试品中乙酰螺旋霉素为标示量的98.4%。

3 不确定度评定

3.1 测量模型：采用二剂量法，通过数学模型对乙酰螺旋霉素的含量测定进行分析，以找出不确定度因素。含量%=Pt/At×100%；效价Pt＝At×D×log-1[0.301×（T2+T1-S2-S1）/（T2+S2-S1-T1）]

式中，T2～12个双碟高浓度供试品溶液抑菌圈直径的总和（mm）；T1～12个双碟低浓度供试品溶液抑菌圈直径的总和（mm）；S2～12个双碟高浓度标准品溶液抑菌圈直径的总和（mm）；S1～12个双碟低浓度标准品溶液抑菌圈直径的总和（mm）；Cs-标准品溶液浓度；Ct-供试品溶液浓度；W对-标准品称量（mg）；S对-标准品的效价（1324 U/mg）；f样-样品的稀释倍数；W平均-平均片重（g）；W样-样品称量（g）；f对-标准品的稀释倍数；常数-0.301为二剂量法剂间浓度比的对数值。

3.2 测定不确定度识别：见表1。

3.3 量化不确定度

3.3.1 抑菌圈直径值的不确定度：对抑菌圈直径的数据进行统计分析，根据效价公式计算效价（Pt）为98403.6247 U/mg，同时统计分析得自由度， 其合并样本标准差即标准不确定度u（x1）为0.209，则相对标准不确定度为u（x1）rel=u（x1）/Pt=2.13×10-6。

3.3.2 抑菌圈测量仪的不确定度：抑菌圈测量仪的最大允许误差为±0.02 mm，服从均匀分布，其标准不确定度u（x2）为0.0115 mm。抑菌圈测量仪的标准圈直径（x）为19 mm，则urel（x2）＝u（x2）/x＝0.0115/19＝6.1×10-4。

3.3.3 试验设计的不确定度：供试品中的乙酰螺旋霉素片的效价为98.4%，测定效价的平均可信限率为4.8%，因置信概率为95%，其包含因子K=1.96，urel（x3）＝0.048/1.96＝2.5×10-2。

3.3.4 标准品称量的不确定度：标准品称量的不确定度包括：①天平称重重复性的不确定度，使用天平对一质量恒定的物体（约20 mg）反复称重10次，其标准偏差为0.0193 mg，属A类不确定度。②称重仪器的不确定度，使用的天平（d＝0.01 mg）由检定证书得到天平的最大允许误差为±0.15 mg，属B类不确定度，服从均匀分布，其标准不确定度0.087 mg，通常称取物质时经二次独立称量，计算得天平校准的标准不确定为0.123 mg。③天平示值的不确定度，使用的天平（d＝0.1 mg）对示值（分辨率）导致的不确定服从均匀分布，天平分辨率为属B类不确定度，天平分辨率为0.01mg，区间半宽a=0.005 mg，其标准不确定度为0.0029 mg。则标准品称量的合成不确定度uc（W对）为6.9×10-3。

表1 测定不确定度识别表

3.3.5 标准品溶液和供试品溶液稀释的不确定度：标准品溶液和供试品溶液稀释的不确定度包括①标准品溶液稀释重复性的不确定度，标准品稀释过程中用到25、50、100 mL容量瓶，2 mL移液管重复10次，属A类不确定度，计算其标准偏差分别为0.017、0.019、0.022、0.0037mL。供试品稀释过程中用到100、50、100 mL容量瓶，2 mL移液管10次，属A类不确定度，计算其标准偏差分别为0.025、0.017、0.023、0.0040 mL。②量取定容容器引入的不确定度，根据《常用玻璃量器检定规程》查得，A等品25 mL（1次）、50 mL（1次）、100 mL（1 次）、容量瓶、2 mL（2次）移液管的最大允许误差分别为±0.03、±0.05、±0.10、±0.010mL，属B类不确定度，服从三角分布，包含因子为，则5个容器的标准不确定度分别为0.00409 mL。③温度引起的不确定度，因为标准品溶液和供试品溶液是在相同条件下制备，温差和溶剂的膨胀系数相同，温度引起的相对不确定度可忽略。则25 mL容量瓶、50 mL容量瓶、100 mL容量瓶、2 mL移液管体积的相对标准不确定度分别为urel（v25）＝8.4×10-4；urel（v50）= 5.6×10-4；urel（v100）=4.7×10-4；urel（v2）=5.6×10-3。则标准品溶液稀释的相对合成不确定度urel（f对）=5.8×10-3；标准品溶液稀释的相对合成不确定度urel（f对）=5.9×10-3。

3.3.6 标准品效价引起的不确定度：乙酰螺旋霉素标准品效价的最大允许误差一般认为是±1%，因置信概率为95%，其包含因子K=1.96，标准品效价相对标准不确定度urel（S对）=0.01/1.96=5.2×10-3。

3.3.7 供试品称量的不确定度：供试品称量的不确定度也包括：①天平称重重复性的不确定度，使用天平对一片供试品反复称重10次，计算其标准偏差为0.0249 mg，属A类不确定度。②称重仪器的不确定度和天平示值的不确定度引入的不确定度见3.3.4，则供试品称量的合成不确定度uc（W样）=0.13 mg，ucrel（W样）=5.0×10-4。

3.3.8 平均片重的不确定度：平均片重的不确定度主要包括：①天平称重重复性的不确定度，,使用天平对20片供试品反复称重10次，计算其标准偏差为0.149mg，属A类不确定度。②称重仪器的不确定度，使用的天平（d＝0.1 mg）由检定证书得到天平的最大允许误差为±1.0 mg，属B类不确定度，服从均匀分布，其标准不确定度为1.0/√3 ＝0.577 mg，通常称取物质时经二次独立称量，计算得天平校准的标准不确定为0.82 mg。③天平示值的不确定度，使用的天平（d＝0.1 mg）对示值（分辨率）导致的不确定服从均匀分布，天平分辨率为属B类不确定度，天平分辨率为0.1 mg，区间半宽a=0.05 mg，其标准不确定度为供试品称量的合成不确定度uc（W平均）= 1.7×10-4。

3.4 总合成标准不确定度uc（x）：总合成相对标准不确定度ucrel（x）＝

3.5 扩展不确定度U和报告结果：结果符合正态分布，在置信水平为95%时，包含因子K＝2，扩展不确定度：U＝K×uc（x）＝2×2.8%＝6%。因此，本品含乙酰螺旋霉素为（98.4±6）%。

4 讨 论

本实验根据不确定度理论对抑菌圈直径值X1、抑菌圈测量仪X2、实验设计X3、标准品称量W对、标准品的效价S对、标准品溶液稀释f对、供试品称量W样、平均片重W平均、供试品溶液稀释f样等9项进行不确定度评定。并在95%的置信区间下，得出本方法所测质量分数结果的扩展不确定度为K×uc（x）＝6%，结合实验过程及计算结果可知，微生物鉴定法测定乙酰螺旋霉素含量的不确定度主要来源为实验方法设计，其次为抑菌圈的测量、标准品溶液和供试品溶液的制备。实验表明选择适宜的实验方法设计，可有效减小试验的不确定度，其次实验过程中的稀释、称量等操作过程对测量结果的不确定度影响也较大。

本实验对微生物检定法测定乙酰螺旋霉素片含量的方法进行分析，建立微生物检定法测定乙酰螺旋霉素片的含量不确定度计算的数学模型。通过对各变量的分析，计算各变量的不确定度，最后计算出合成标准不确定度。结果表明采用该方法建立的数学模型可用于测定乙酰螺旋霉素片微生物检定法含量检测中的不确定度估算。为评价该方法的准确性和可靠性提供依据。

[1] 贺丽娜,李世颂.紫外分光光度法测定乙酰螺旋霉素片的含量[J].佳木斯医学院学报,1998,21(1)：45.

[2] 董帮兴,刘红,汪玉萍.比浊法测定乙酰螺旋霉素片的含量[J].现代医药卫生,2008,24(3)：333-334.

[3] 中国药典2015年版[M].二部.北京：中国医药科技出版社,2015.

[4] 国家质量监督检验检疫总局.JJF 115-2005化学分析测量部确定度评定[S].北京：中国计量出版社,2005.

[5] 陆明,范国荣,汪洋,等.测量不确定度在药品检测领域的研究进展[J].中国药事,2013,27(5)：485-492.

[6] 郜振华,郜建华.乙酰螺旋霉素片含量测定不确定度评定[J].中外医疗,2009,28(17)：116-119.