小鼠N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V在皮肤及肝细胞中的生理作用

张毓青，崔乃强

在细胞分化、致癌过程中可以观察到糖基化的变化，被糖基转移酶这样的蛋白调控。每个寡糖的合成都需要糖基转移酶，而这一酶是由特定的基因编码的。这些基因构成了约1%的人类基因组。在糖工程的最新进展中，分子生物学已阐明寡糖的生物学功能[1]通常是复杂的分子相互作用的结果。即使在小鼠中敲除或过表达单糖基因，各种不同的糖蛋白也会改变其糖结构。当前的分子生物学技术手段不可能单独改变单糖蛋白结构中特定的一种寡糖，因此，需要全面、有针对性的分析，了解生物每个低聚糖的具体功能。目前研究人员的注意力都集中在重要靶糖蛋白上，这些糖蛋白在特定的器官中是举足轻重的角色。例如，表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）在皮肤细胞增殖的作用，和血管内皮细胞转化生长因子-β（vascular endothelial cell transforming growth factor-β,TGF-β）受体及其信号通路都是肝纤维化研究中的重点。N-乙酰葡糖胺转移酶 -V（N-acetylglucosamine transferase-V,GnT-V），是一种糖基转移酶，由Mgat5编码的糖基转移酶催化N-乙酰氨基葡萄糖的β1、6 N-聚糖支链而形成，被认为与癌症生长和转移相关[2-3]。1987年首次报道了GnT-V与癌症转移相关[4]，随后，1993年Mgat5基因从大鼠[5]和人类中被克隆[6]。共有三个不同的信号通路被认为是由GnT-V介导且参与促进癌症转移。第一条信号通路涉及在β1-6GlcNAc和半乳糖凝集素-3上聚乳糖胺之间形成晶格，上调EGF-R信号，从而导致受体的胞吞作用被抑制[7]。第二条信号通路中，转移酶-V通过添加β1-6GlcNAc分支结构，抑制蛋白酶降解，促进转移[8]。第三个途径包括抑制E-钙粘蛋白/β-连环蛋白复合体的功能[9]。GnT-V基因敲除小鼠（Mgat5-/-小鼠）中诱导乳腺肿瘤生长和转移的多瘤病毒中间型T癌基因显著地降低，表明转移酶-V对癌生长和转移[10]是必不可少的。然而，临床研究中的GnT-V的免疫组化研究已经证实：GnT-V并不总是一个预后差的标记。虽然预后较差的结肠癌、乳腺癌和食道癌中表现出GnT-Ⅴ的高表达，相反在肺癌、甲状腺癌及肝癌中观察到低表达。这种差异可能是由于不同的肿瘤中GnT-V不同的靶蛋白造成的。然而，作为预后标志物，在几乎所有癌症的早期阶段，GnT-V的表达量均升高。因此， EGF-R信号的上调和蛋白酶的活化是癌变的早期事件。所以，使用β-肌动蛋白启动子建立GnT-V转基因小鼠（GnT-V Tg小鼠），可能确定哪些器官将患癌症。但是出人意料的是，在GnT-V的转基因小鼠中没有观察到的任何器官的自发的癌症。不过，该鼠展示了GnT-V在皮肤和肝细胞中的生理作用，以及这些组织的中对刺激物的影响。

1 GnT-V转基因小鼠中上皮-间质转化（epithelialinterstitial transformation，EMT）表型的观察

EMT特点是上皮丢失和间充质特性的获得，在生物进程中起着根本性的作用，如伤口愈合、胚胎发展以及癌细胞的侵袭和转移[11]。在成人中，EMT通过细胞因子的释放对组织损伤做出回应，介导了成纤维细胞在炎症和伤口愈合中的产生[12-13]。在伤口愈合中再上皮化涉及上皮细胞的运动或迁移，在伤口边缘移动的上皮细胞获得间充质特性，经历EMT的早期阶段迁移[12]。先前Demetriou等[14]通过体外研究证实，在貂肺上皮细胞(Mv1Lu)细胞过表达GnT-Ⅴ增强了这些细胞在划痕实验中的迁移，表明的GnT-V对EMT的作用。有一篇关于GnT-Ⅴ Tg小鼠皮肤EMT样表型的报道[15]。GnT-ⅤTg小鼠的皮肤通过用胶纸反复去除角质层后局部更容易被损坏，这表明细胞-细胞的黏附在这些小鼠中是极易被损害的。正如预期的那样，E-cadherin，最重要的一个细胞黏附分子的表达，在GnT-ⅤTg小鼠分离出来的胶质细胞中显着地降低。相反，间充质蛋白质如N-钙粘蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的表达增加。另外，从GnT-ⅤTg小鼠分离出的角质细胞的迁移显著增强。这些改变主要是由于EMT调节转录因子，如捻蛋白（twist）和蜗牛蛋白（snail）的表达增加有关，twist和snail的表达增加是通过活化通常引起EGF或TGF-β受体介导的信号传导途径诱导的。

有报道称，在肿瘤细胞中加入β1-6GlcNAc支链到这些受体能抑制细胞内吞作用，并延长这些分子的信号[7]。GnT-V Tg小鼠角化细胞中的EGF-R的信号增强，表明在正常的角质形成细胞中有相似的糖信号发生。为了在体内评价EMT的表型和增强GnT-V Tg鼠角质细胞的迁移，科学家们进行了皮肤伤口愈合实验，在GnT-V Tg小鼠和对照组小鼠背部制作8 mm的圆形伤口。第4 d，GnT-V Tg转基因小鼠伤口面积比对照组显著小。值得注意的是，GnT-V Tg转基因小鼠的再上皮化速度更快。总之，在GnT-V Tg小鼠皮肤上观察到的GnT-V促进EMT和促进角质细胞活力和皮肤伤口愈合的功能可能部分地由EGF受体介导的信号通路调控。

2 GnT-V通过EGF-R信号通路调节角质细胞的形成维持皮肤的稳态

在炎症和细胞增殖中GnT-V的表达增加[16-17]。通过上调GnT-Ⅴ给它们的受体增加β1,6GlcNAc支链，增加生长因子和/或细胞因子的表达。EGF-R介导的信号通路在维持皮肤稳态中也起着重要的作用。成熟健康的表皮细胞的增殖是通过平衡EGF家族的不同成员的信号来实现的，如肝素结合表皮生长因子（heparin binding epidermal growth factor,HB-EGF）、TGF-α、双调蛋白，这些均在表皮中与EGF-R结合[18-19]。

尽管GnT-V Tg小鼠中皮肤比其他器官GnT-V蛋白的表达高，但GnT-Ⅴ Tg小鼠或正常条件下的GnT-V缺陷的皮肤中无组织学变化[15]。但是，转移酶-V缺陷小鼠在佛波酯-三苯基甲酸(TPA)处理后表皮异常的增生减少[20]。TPA诱导生产HB-EGF，在角质形成细胞的增殖中起着重要的作用。HB-EGF的产生为膜-锚定形式，然后被细胞表面蛋白酶切割。TPA刺激这些蛋白酶的激活，导致可溶性的HB-EGF的水平增加。GnT-V缺陷的小鼠中TPA诱导的表皮增生的结果表明：通过HB-EGF下调EGF-R水平，而EGF-R信号对HB-EGF的应答表现为培养的GnT-V缺陷小鼠的角质形成细胞的下调。此外，对条件培养基增加HB-EGF或TPA诱导培养的角质形成细胞上调GnT-V的表达[21]。增加的GnT-Ⅴ活性有助于增加β1-6GlcNAc N-聚糖EGF上的支链，导致晶格的形成，从而抑制细胞EGF-R内吞作用，增强EGF-R的信号。因此，由HB-EGF调节的GnT-Ⅴ在细胞增殖过程中保持稳态起着重要的作用。正常和过度增殖性皮肤中的GnT-Ⅴ的作用又被称为“GnT-V的皮肤循环”。GnT-Ⅴ和HB-EGF相互加强对方的表达和功能，具有协同作用。

3 GnT-V在脂肪性肝炎中的作用

虽然GnT-Ⅴ的表达在正常肝组织中是相当低的，但在慢性肝炎和肝再生的条件下表达增加[16-17]。以前的研究已经表明：糖基转移酶的转基因小鼠由于肝细胞中脂蛋白的积累可以发展为脂肪肝[21-22]。但是，在正常条件下，GnT-V Tg小鼠没有表现出脂肪肝表型。其中一个原因是由于GnT-V Tg小鼠肝脏中GnT-V的表达量比其它器官低，与肝脏缺乏脂肪的转化有关。非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）是世界上最常见的慢性肝病之一，而在工业化国家产生越来越多的医疗问题[23]。已观察NAFLD的组织学变化，从单纯的脂肪变性（通常是非进展型的）到非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH），一部分NASH患者发展为肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）[24]。最近的研究表明：在人类和啮齿动物中，饮食中的胆固醇是NASH的一个重要的危险因素。

当给GnT-V Tg和野生型小鼠高脂肪和高胆固醇饮食，与野生型小鼠相比GnT-V Tg小鼠淋巴细胞浸润被显着抑制。高胆固醇饮食是小鼠NASH最好的模型之一，因为它能诱导小鼠肝脏的炎症和纤维化[25]。由于慢性肝炎中的GnT-V的表达升高[16]，给GnT-V Tg小鼠高胆固醇饮食可作为了解在肝脏中上调GnT-V的生物学效应的手段[26]。当喂小鼠正常食物时，测定体重、肝脏重量和肝脏与体重比，野生型小鼠较GnT-V Tg小鼠均显著较高。与此相反，高胆固醇饮食下野生型小鼠较GnT-V Tg小鼠在肝脏重量和肝脏与体重比显著下降。正常饮食或高胆固醇饮食GnT-VTg小鼠比野生型小鼠血清甘油三酯，肝脏中甘油三酯或胆固醇含量无明显差异。正常饮食下，GnT-VTg小鼠与野生型小鼠肝脏胆固醇没有差异，但高胆固醇饮食下GnT-V Tg小鼠相比于野生型小鼠肝脏胆固醇水平显著降低。GnT-V Tg小鼠肝中淋巴细胞浸润抑制被认为是由于T细胞向Th2的转变。因此，Th1细胞因子如白细胞介素-6、干扰素-γ、肿瘤坏死因子α水平在GnT-V Tg小鼠肝脏中受到显抑制[26]。GnT-V Tg小鼠相比于野生型鼠血清谷丙转氨酶水平也较低。

4 GnT-V Tg小鼠抑制肝脏纤维化的的分子机制

4周时与野生型小鼠相比，高胆固醇饮食喂养的GnT-V Tg小鼠肝脏纤维化受到了抑制。虽然肝纤维化与肝脏炎症相关，胞外基质蛋白的积累取决于非实质细胞在肝脏的功能。肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）在肝非实质细胞纤维化中是最重要的角色[27]。HSC产生TGF-β，它是在纤维化过程中一个非常重要的细胞因子，TGF-β刺激HSC产生更多的TGF-β，产生正反馈。当原代培养的HSC用外源性TGF-β处理，GnT-V Tg小鼠的HSC与野生型小鼠同类细胞相比产生较高的TGF-β。甚至在没有外源性TGF-β的情况下，RT-PCR结果显示，转移酶-V Tg的HSC中TGF-β的mRNA水平增加。这些结果表明GnT-V增强TGF-β的信号传导，这是依赖于与EGF-R介导的机制[7]。细胞核Smad3基因是TGF-β是否信号增强的有用指标。HSC细胞质提取物Smad3的蛋白表达在TGF-β刺激后下降，在野生型和GnT-V Tg小鼠HSC的TGF-β刺激显著增加了核Smad3的蛋白水平。有趣的是，核Smad3的蛋白水平相比于野生型小鼠GnT-V Tg的HSC在TGF-β刺激后显著升高。这些结果表明，在HSC中GnT-V的转基因小鼠的TGF-β信号传导增强。然而，GnT-ⅤHSC的Ⅰ型胶原表达的显著下降。与野生型HSC相比，GnT-V Tg小鼠的HSC中COX-2基因的表达水平升高，COX-2是 PGE2生产中的限速酶。已有报道HSC中，TGF-β刺激COX-2的表达，COX-2衍生的PGE2抑制TGF-β1诱导的胶原蛋白产生[28]。塞来昔布，是GnT-V Tg小鼠的HSC中COX-2的选择性抑制剂，能降低PGE2产生和上调Ⅰ型胶原基因的表达。通过增强COX2表达，持续刺激TGF-β，此负反馈信号能够降低GnT-V Tg小鼠的肝脏和HSC的胶原蛋白的表达。

5 展望

对小鼠进行涉及寡糖合成初始步骤的糖基敲除有时是致命的[29]。然而，敲除其它糖相关基因，该基因敲除小鼠比野生型小鼠常表现为有限的表型表达或只有很小的器官上的差别。在这种情况下，应该进行刺激实验。在人类疾病中，特定基因的完全缺陷是相对罕见的。另一方面，涉及炎症和再生的多个基因部分缺陷和一些基因的异常是常见的。在GnT-V Tg小鼠的皮肤和肝脏中观察到的表型不能在正常条件下进行检测。这些微观和宏观的改变可以导致疾病的发生，多个团队利用转基因和基因敲除小鼠进行实验[30-31]。在糖生物学研究的新时代，这样的实验会产生小鼠涉及寡糖重塑性的疾病模型，GnT-V的转基因小鼠进行肿瘤诱导，将是最有前途的研究。同样重要的是要考虑在实验中使用癌基因和转基因小鼠。

[1] Hart GW, Copeland RJ. Glycomics hits the big time[J].Cell,2010,143(5): 672-676.

[2] Taniguchi N, Miyoshi E, Ko JH, et al. Implication of N-acetylgl ucosaminyltransferases III and V in cancer: gene regulation and signaling mechanism[J]. Biochim Biophys Acta,1999,1455(2-3):287-300.

[3] Lau KS, Dennis JW. N-Glycans in cancer progression[J].Glycobiology, 2008,18(10): 750-760.

[4] Dennis JW, Laferte S, Waghorne C, et al. Beta 1-6 branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis[J].Science,1987,236(4801): 582-585.

[5] Shoreibah M, Perng GS, Adler B, et al. Isolation,characterization,and expression of a cDNA encoding N-acetylglucosaminyltransferase V[J]. J Biol Chem,1993,268(21):15381-15385.

[6] Saito H, Nishikawa A, Gu J, et al. cDNA cloning and chromosomal mapping of human N-acetylglucosaminyltransferase V[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1994, 198(1):318-327.

[7] Partridge EA, Le Roy C, Di Guglielmo GM, et al. Regulation of cytokine receptors byGolgi N-glycan processing and endocytosis[J]. Science, 2004,306(5693):120-124.

[8] Guo HB, Lee I, Kamar M, et al. N-acetylglucosaminyltransferase V expression levels regulatecadherin-associated homotypic cellcell adhesion and intracellular signaling pathways[J]. J Biol Chem,2003,278(52):52412-52424.

[9] Ihara S, Miyoshi E, Ko JH, et al. Prometastatic effect of N-acetylglucosaminyltransferase V is due to modification and stabilization ofactive matriptase by adding beta 1-6 GlcNAc branching[J]. J Biol Chem,2002,277(19): 16960-16967.

[10] Granovsky M, Fata J, Pawling J, et al. Suppression of tumor growth and metastasis in Mgat5-deficient mice[J]. Nat Med,2000,6(3):306-312.

[11] Zeisberg M, Neilson EG. Biomarkers for epithelial-mesenchymal transitions[J]. J Clin Invest,2009,119(6):1429-1437.

[12] Yan C, Grimm WA, Garner WL, et al. Epithelial to mesenchymal transition in human skin wound healing is induced by tumor necrosis factor-alpha through bone morphogenic protein-2[J]. Am J Pathol,2010,176(5):2247-2258.

[13] Kalluri R, Neilson EG. Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis[J]. J Clin Invest,2003,112(12):1776-1784.

[14] Demetriou M, Nabi IR, Coppolino M, et al. Reduced contactinhibition and substratum adhesion in epithelial cells expressing GlcNAc-transferase V[J]. J Cell Biol,1995,130(2):383-392.

[15] Terao M, Ishikawa A, Nakahara S, et al. Enhanced epithelial-mesenchymal transition-like phenotype in N-acetylglucosaminyltransferase V transgenic mouse skin promotes wound healing[J]. J Biol Chem,2011,286(32):28303-28311.

[16] Miyoshi E, Nishikawa A, Ihara Y, et al. N-acetylglucosaminyltransferase III and V messenger RNA levels in LEC rats during hepatocarcinogenesis[J].Cancer Res, 1993,53(17):3899-3902.

[17] Miyoshi E, Ihara Y, Nishikawa A, et al. Gene expression of N-ac etylglucosaminyltransferases III and V: a possible implication for liver regeneration[J]. Hepatology,1995,22(6): 1847-1855.

[18] Pastore S, Mascia F, Mariani V, et al. The epidermal growth factor receptor system in skin repair and inf l ammation[J]. J Invest Dermatol， 2008,128(6):1365-1374.

[19] Yoshida A, Kanno H, Watabe D, et al. The role of heparin-binding EGF-like growth factor and amphiregulin in the epidermal proliferation of psoriasis in cooperation with TNFalpha[J]. Arch Dermatol Res,2008,300(1):37-45.

[20] Kimura A, Terao M, Kato A, et al. Upregulation of Nacetylgluco saminyltransferase-V by heparin-binding EGFlike growth factor induces keratinocyte proliferation and epidermal hyperplasia[J].Exp Dermatol,2012,21(7): 515-519.

[21] Ihara Y, Yoshimura M, Miyoshi E, et al. Ectopic expression of N-acetylglucosaminyltransferase III in transgenic hepatocytes disrupts apolipoprotein B secretion and induces aberrant cellular morphology with lipid storage[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(5):2526-2530.

[22] Wang W, Li W, Ikeda Y, et al. Ectopic expression of alpha1,6 fucosyltransferase in mice causes steatosis in the liver and kidney accompanied by a modification of lysosomal acid lipase[J]. Glyco biology,2001,11(2):165-174.

[23] Ford ES, Giles WH, Dietz WH. Prevalence of the metabolic syndrome among US adults:findings from the third National Health and Nutrition Examination Survey[J].JAMA,2002,287(3):356-359.

[24] Bugianesi E, Leone N, Vanni E, et al. Expanding the natural history of nonalcoholic steatohepatitis: from cryptogenic cirrhosis to hepatocellular carcinoma[J]. Gastroenterology,2002,123(1):134-140.

[25] Matsuzawa N, Takamura T, Kurita S, et al. Lipid-induced oxidative stress causes steatohepatitis in mice fed an atherogenic diet[J]. Hepatology,2007,46(5): 1392-1403.

[26] Kamada Y, Mori K, Matsumoto H, et al. NAcetylglucosaminyltransferase V regulates TGF-beta response in hepatic stellate cells and the progression of steatohepatitis[J]. Glycobiology,2012,22(6):778-787.

[27] Friedman SL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis[J].Gastroenterology,2008, 134(6):1655-1669.

[28] Hui AY, Dannenberg AJ, Sung JJ, et al. Prostaglandin E2 inhibits transforming growth factor beta1-mediated induction of collagen alpha 1(I) in hepatic stellate cells[J]. J Hepatol,2004,41(2):251-258.

[29] Ioffe E, Liu Y, Stanley P. Essential role for complex N-glycans in forming an organized layer of bronchial epithelium[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1996, 93(20):11041-11046.

[30] Shinzaki S, Iijima H, Fujii H, et al. Altered oligosaccharide structures reduce colitis induction in mice defective in beta-1,4-galactosyltransferase[J]. Gastroenterology,2012,142(5):1172-1182.

[31] Gao C, Maeno T, Ota F, et al. Sensitivity of heterozygous alpha1,6-fucosyltransferase knock-out mice to cigarette smoke-induced emphysema: implication of aberrant transforming growth factorbeta signaling and matrix metalloproteinase gene expression[J]. J Biol Chem,2012,287(20): 16699-16708.