环状RNA相关功能研究进展

李鳌 闫洪锋 孙宏伟 崔彦,

环状RNA或称环形RNA(circular RNA,circRNA)是存在于生物体内的一类特殊非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)分子,该分子最早由Sanger等[1]于1976年发现。最初被认是错误剪接、遗传意外、甚或实验人为因素等所致的一种副产品,并未引起学术界关注[2-3]。后续研究发现,circRNA相对稳定,广泛存在于真核细胞生物中,推测其极有可能属于转录产物,相关研究遂逐渐兴起,成为继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)之后的又一研究焦点[4-5]。随着RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)等生物信息学技术的广泛发展和应用,遍布生物体内且功能多样的circRNA被发现,引起学术界的广泛兴趣[5-6]。笔者对circRNA的生成、生物学功能、作用机理及其与疾病关系的研究进展作一综述。

一、circRNA的生成及种类

通常情况下,生命信息通过DNA将遗传信息转录给前体mRNA,后者通过剪除非编码信息内含子序列,将有编码功能的外显子序列剪辑形成线性RNA分子,经转录后翻译,生成功能蛋白质而参与生命过程。真核生物通常经过调控可变剪接,由一个基因编码形成多种功能各异的RNA从而生成不同的蛋白产物;另外还可通过反向可变剪接途径使基因外显子序列反向首尾连接而生成circRNA。circRNA的环化机制包括外显子环化和内含子环化,通常由可变剪接产生的前体mRNA(pre-mRNA)通过核酸分子间的闭合键构成单链环形结构,形成包含1～5个外显子或1～2个内含子的基因转录产物[5-8]。

circRNA的外显子环化包括套索驱动环化(lariat-driven circularization)和内含子配对驱动环化(intron-pairing-driven circularization)两种模式。前者与线性pre-mRNA正向剪接相反,即在可变剪切过程中,外显子跳跃(exon skipping),pre-mRNA的下游外显子SD的3’剪接供体(spice donor)共价结合到上游外显子SA的5’剪接受体(spice acceptor),形成套索结构。随后切除内含子,促进了序列成环,形成具有两外显子的circRNA。在后一种模式中,由两个内含子依照碱基互补配对规则形成环状结构,然后切除内含子,形成circRNA[9]。仅由外显子构成的circRNA称为exonic circRNA,主要定位于细胞质中,而由内含子构成的circRNA称为intronic circRNA。内含子环化过程主要发生在细胞核中,有赖于含有邻近5’剪接位点7个核苷酸GU富集元件和分支点11个核苷酸C富集元件而形成[10-11]。有学者研究发现环化外显子之间有保留内含子的现象,即外显子-内含子circRNA(exon-intron circRNA or EIciRNA)[12],其机制尚未明确。

二、circRNA的特征

circRNA广泛存在于自然界生物体内,人类及其他多种原核及真核生物体内均含有丰富而种类众多的circRNA。研究发现,在母基因转录本中circRNA约占5%～10%,与线性RNA相比,circRNA在体内的含量可达前者的20倍。有学者指出,circRNA是比mRNA丰度更高、更为主要的转录本[10,13-14]。

circRNA大部分来源于外显子,少部分来源于内含子,具有高度稳定性,不易被核酸外切酶RNase R(Ribonuclease R,RNase R)降解,却可以被小型干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)降解[9]。

circRNA具有高度的组织时序特异性。研究证实,在乳腺癌细胞系MCF-7中DOCK1基因circRNA高度表达,而在肺癌细胞系A549中则几乎不表达[15]。Li等[16]研究证实,在线虫胚胎细胞发育的不同时期,环状RNA种类完全不同[15]。另有学者使用原位荧光杂交技术观察到在细胞核或细胞质中circRNA的高度聚集性,如ciRS-7聚集在细胞质中,而circEIF4J和ci-ankrd52则聚集于细胞核内[17-18]。

circRNAs具有很强的保守性。有学者研究发现,在人体成纤维细胞中有2000余种circRNAs可与小鼠基因组匹配,其中近1/3的小鼠基因能产生相同的circRNAs[9]。

三、circRNA的功能

1.circRNA具有mRNA分子海绵作用:circRNA与microRNA、lncRNA均含有大量的mRNA应答元件,均属于竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)。

circRNA作为一种ceRNA,充当miRNA“海绵”,抑制microRNA的负性调控作用,提高靶基因功能活性[18]。研究发现,在人和鼠脑组织中,有一种circRNA称之为小脑变性相关蛋白1反义转录物(antisense tothe cerebellar degeneration- related protein 1 transcript,CDR1as),包含74个miR-7结合位点,充当miR-7a/b的海绵样作用,对miR-7起负调控作用。若CDR1as过表达,则与miR-7结合,提升miR-7靶基因表达水平;如CDR1as表达受到抑制,则miR-7靶基因表达水平下降[20-21]。Ashwal-Fluss等[22]通过荧光素酶筛选试验插入miR-7靶点或整个ciRS-7序列到海肾荧光素酶的3’非翻译区(UTR)监测miR-7活性,发现miR-7和ciRS-7表达载体共转染荧光素酶报告基因的击倒潜力显着降低,而非circRNA产生载体ciRS-7-ir对敲击作用不大。Zheng等[23]研究证实,当荧光素酶报告基因发生突变时,microRNA转染对荧光素酶活性无明显影响,同时发现,circHIPK3直接结合并抑制microRNA-124活性,对9个microRNAs和18个潜在microRNA结合位点具有海绵调节作用。Xue等[24]研究HaCaT细胞中circRNA表达及作用,发现circ100284通过miR-217海绵作用,调控亚砷酸盐对HaCaT细胞的增生周期和恶性转化过程。

2.circRNA调控可变剪切:circRNA通过特殊可变剪切而生成,其生物发生和规范剪接之间存在着激烈的竞争。携带circRNA外显子和侧翼内含子的小基因能有效生成circRNA,而引入携带强50和30个拼接位点的侧翼外显子则显著降低果蝇Luna小基因的环化效率,显示了外显子环化和剪接之间的激烈竞争[17,22,25]。研究发现,提升果蝇和人细胞内的有效线性剪接会导致circRNA生成减少,说明外显子环化与经典pre-mRNA线性剪接之间存在一种竞争及平衡关系[22]。一系列研究结果表明,circRNA具有调节pre-mRNA剪接进而影响蛋白质生成的作用。

3.circRNA与蛋白质有特殊关联作用:研究证实,circRNA可与相关蛋白结合形成复合体,抑制相应功能蛋白的活性,如此而发挥生物调控功能[21-22]。Du等[26]研究发现,CDK2和p21可能与circ-Foxo3结合,形成circ-Foxo3-p21-CDK2三元复合物与p2一起劫持CDK2,避免形成细胞周期蛋白E/CDK2复合物,因此阻断了S期细胞周期,并通过与应激和衰老相关蛋白结合而促进细胞衰老。Yang等[27]研究证明,circRNA circotin1通过circ-Amotl1增强Stat3的核易位发生细胞活性增加,Nu3明确Stat3可以绑定到Dnmt3a启动子,促进转录和翻译Dnmt3a,进而影响相关靶标的蛋白质表达,这些蛋白质的表达增加促进了细胞增殖、存活、粘附和迁移,具有加速创面修复的作用。

4.circRNA调控基因转录:circRNA有别于传统线性RNA,具有闭合环状结构,大量存在于真核转录组中。一系列研究结果表明,细胞核中含有丰富的circRNA分子,可与 RNA聚合酶转录复合体结合,对RNA包括其母系基因的转录进行调控,进而影响母系基因及其靶基因的表达[16-17,28]。

5.circRNA具有潜在翻译功能:研究发现,circRNA在人骨肉瘤细胞中发挥一定的翻译功能[29];circRNA在大肠杆菌和人类细胞中能够通过滚圆扩增(rolling circle amplification,RCA)机理进行有效翻译,产生大量蛋白产物[30]。从目前情况看,有关circRNA的翻译功能尚未完全清楚,有待进一步研究。

四、circRNA与疾病

近年来的研究表明,circRNA与动脉粥样硬化[31]、糖尿病[32]、神经系统疾病[33]、血管生成[34]等密切相关,参与疾病与生理过程的调控。尽管对于这些生物分子的表达机制认识有限,但研究发现数百种circRNA与人类多种肿瘤有关,包括肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌和血液恶性肿瘤以及中枢神经系统肿瘤[35]。这方面的研究方兴未艾,有可能对揭示疾病机制和发现诊疗靶标具有重要意义。

五、展望

与lnRNA和miRNA相比,circRNA作为RNA家族升起的一颗新星,关于其功能机制的探索尚待深入研究。相关研究已显示出circRNA在应用方面的潜能,譬如,有研究发现癌症细胞外泌体中含有丰富的能在体液中检测到的circRNAs[36];circRNA表达谱综合分析显示hsa-circ-0005075作为环状RNA 生物标记物,参与肝癌的发生发展,具有潜在的肝癌标志物价值[37]。一系列研究表明,circRNA在遗传、肿瘤等多种疾病的发生发展过程中发挥重要调控作用,籍此认为其有望成为新的诊断标志物和治疗靶标[38-39]。这方面的研究方兴未艾,有待深入探讨。