高效液相色谱法测定杜仲黑茶中绿原酸和咖啡因的含量

朱冰

摘 要：建立高效液相色谱法测定杜仲黑茶中绿原酸和咖啡因的含量，以ZORBAX SB-C18 （250 mm × 4.6 mm i.d.，5μm）为色谱柱，0.4%醋酸水溶液和乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱，流速0.8 mL/min，检测波长254 nm，柱温25，绿原酸和咖啡因能得到较好的分离。在2.0～150.0 μg/mL浓度范围内，绿原酸和咖啡因的峰面积和浓度呈良好的线性关系（r> 0.9990），精密度（RSD <2%）和准确度（97.80%～101.44%）高。建立的高效液相色谱方法简便、准确，适合杜仲黑茶中绿原酸和咖啡因的含量分析。

关键词：杜仲黑茶；绿原酸；咖啡因；高效液相色谱；质量控制

中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 收稿日期：2017-10-14

杜仲是我国传统名贵中药，杜仲叶和杜仲皮的功能活性成分相同：环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类和多糖类化合物[1][2]；同时具有类似的保健功效：抗高血压、抗高血脂、抗菌、抗肥胖、抗氧化、保护神经等[3][4][5]。由于杜仲皮供给紧张，杜仲叶资源丰富，因此杜仲叶的综合开发利用前景广阔，而杜仲茶是其中的典型代表。中国的制茶工艺多种多样，杜仲黑茶是张家界茶坤缘生物科技开发有限公司研发的新产品，以杜仲叶和茶叶（8∶2， m/m）为原料混合，经过杀青、渥堆发酵、蒸压等工序制成。《中华人民共和国药典》确定绿原酸为杜仲叶药材的主要药用有效成分及其含量标准[6]。茶叶具有抗氧化、抗癌、降血糖、提高免疫等功效，茶多酚和咖啡因是茶叶中主要功效成分[7]。研究表明，黑茶的制备工艺会影响茶叶内成分的含量变化，主要化学成分的含量不同程度地降低，而咖啡因是黑茶的特征功效之一，研究咖啡因的含量有助于更好地认识黑茶。鉴于此，建立杜仲黑茶中绿原酸和咖啡因的含量的检测方法，可建立杜仲黑茶的质量评价标准，保证杜仲黑茶的安全性和有效性[8]。但是，目前未见相关研究报道。

目前测定中药或食品等中目标化合物的方法主要为高效液相色谱法（High-

performance liquid chromatography， HPLC），简单有效，选择性高，重现性高且分离效率高。检测器有质谱检测器和紫外检测器，质谱检测器具有高灵敏度的特点，但是设备昂贵，难以推广应用；紫外检测器对具有紫外吸收的化合物通用，灵敏度较高、重现性好。绿原酸和咖啡酸均具有紫外吸收，可使用紫外检测器进行检测。因此，本文拟建立高效液相色谱方法测定杜仲黑茶中绿原酸和咖啡因的含量，研究结果为杜仲黑茶活性成分的定量分析提供方法参考，同时为杜仲新型功能茶的開发提供事实依据。

一、实验部分

1.仪器与试剂

安捷伦1260高效液相色谱仪（Agilent Technologies， Santa Clara， CA），包括四元泵、自动进样器、恒温箱和二极管阵列检测器。

杜仲黑茶于2017年2月购自张家界茶坤缘生物科技开发有限公司。绿原酸和咖啡因标准品购自上海同田生物技术股份有限公司。色谱纯乙腈和乙酸购自美国飞世尔科学世界公司，其他分析纯试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，水为超纯水。

2.色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18 （250 mm × 4.6 mm i.d.，5μm）；预柱：菲罗门C18（4.0 mm×3.0 mm， Phenomenex， Torrance， CA）。流动相：溶剂A（0.4%醋酸水溶液）和溶剂B（乙腈），梯度洗脱过程为0～10 min，12% B；10～16 min，12%～18% B；16～40 min，18% B。流速：0.8 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：254 nm；进样量：20 μL。

3.杜仲黑茶提取物溶液的制备

将杜仲黑茶干燥粉碎，精密称取样品10.00 g至圆底烧瓶中，用100 mL 75%的乙醇85 ℃回流提取三次，每次2 h，合并滤液过滤后减压浓缩成浸膏，得到1.99 g粗提物。精密称取0.10 g 粗提物，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm滤膜过滤得供试品溶液（10.0 mg/mL）。

二、结果与讨论

1.色谱条件的选择及优化

绿原酸的紫外扫描最大吸收波长为242，300（sh），325 nm；咖啡因的最大吸收波长为275 nm。为了同时灵敏地检测绿原酸和咖啡因，选择检测波长为254 nm。

由于杜仲黑茶中化学成分结构多样，极性相差较大，因此试验中采用梯度洗脱。醋酸能够抑制多酚类化合物中酚羟基的离解，改善分离效果和峰型。比较甲醇和乙腈作为流动相时不同梯度洗脱程序下的HPLC谱图发现，以乙腈作为流动相分离度较好，峰形对称性高，无拖尾现象。因此，在流速为0.8 mL/min时，选用0.4%醋酸水溶液（A）和乙腈溶液（B）为流动相进行梯度洗脱： 0～10 min，12% B；10～16 min，12%～18% B；16～40 min，18% B。在此色谱条件下，绿原酸和咖啡因能达到基线分离，且基本不受其他杂质峰影响，整个分离在40 min内能够完成，能满足定量分析的要求，详见HPLC色谱图。通过与标准品的保留时间对比分析，主要化合物1和2被鉴定为绿原酸和咖啡因。

2.方法的线性范围与检出限

将混合对照品储备液用乙腈稀释成5个浓度系列的混合对照品标准工作液，在上述色谱条件下进行HPLC分析，记录峰面积，以对照品浓度X （μg/mL）对其峰面积的平均积分值（Y）进行线性回归，得回归方程、线性范围、相关系数以及检出限（S/N =3）（表1）。结果表明：绿原酸和咖啡因在2.0～150.0 μg/mL范围内线性关系良好。endprint

3.方法的精密度、稳定性、重现性和回收率

对同一混合对照品溶液重复测定6次， 每次进样20 μL，测定峰面积，得绿原酸和咖啡因的RSD分别为0.93 %、1.25 %，表明精密度良好；连续重复测定3天， 绿原酸和咖啡因峰面积的RSD分别为1.93 %、1.04 %，说明对照品溶液在3天内稳定性良好；对同批样品分别制备混合对照品，测定绿原酸和咖啡因峰面积的RSD分别为1.42 %和1.69 %，表明同批次样品重现性良好。

经过测定，取绿原酸和咖啡因含量分别为76.02 μg/mL和135.10 μg/mL的杜仲黑茶溶液3份，每份各1 mL，分别加入浓度为100.00 μg/mL的混合对照品溶液1 mL、混合的2 mL溶液，分别进样20 μL， 结果见表2，回收率97.80%～101.44%，说明加标回收率良好，准确度高。

4.样品处理方法的考察

考察了不同浓度的甲醇或乙醇（50%， 75%， 95%）、不同温度（70℃， 85℃， 95℃）、不同药材-溶液比（1∶6， 1∶8， 1∶10， 1∶12），不同回流提取次数（1， 2， 3），每次回流提取时间（1h， 2h， 3h）对杜仲黑茶中绿原酸和咖啡因的提取影响。其中10.00 g杜仲黑茶，加入100 mL 75%的乙醇，在85 ℃时回流提取三次，每次2 h，杜仲黑茶的绿原酸和咖啡因提取率最高。

5.样品检测

测定样品3次， 根据标准曲线计算出绿原酸和咖啡因的含量分别为4.54 ± 0.13mg/g和8.07 ± 0.25 mg/g。

三、结语

绿原酸和咖啡因是杜仲黑茶的主要成分，本实验首次建立了HPLC法同时测定杜仲黑茶中绿原酸和咖啡因含量的方法，所建立的测定方法简便、重复性好、精密度高，为杜仲黑茶的质量控制提供了参考依据。

参考文献：

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[3]HE XR，WANG JH，LI MX， et al.Eucommia ulmoides Oliv.：ethnopharmacology， phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine [J].Journal of Ethnopharmacology，2014，151（1）： 78-92.

[4]阿來·赛坎，文 娥，田树革.高效液相色谱同时测定杜仲叶中4种有效成分的含量[J].国际药学研究杂志，2016，43（3）：571-574.

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[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：241.

[7]申 雯，黄建安，李 勤，等.茶叶主要活性成分的保健功能与作用机制研究进展[J].茶叶通讯，2016，43（1）：8-13.

[8] 罗 婧，顾颖颖，刘易成，等.不同茶叶中茶多酚和咖啡因成分的对比分析[J].贵州茶叶，2013，43（1）：10-15.endprint