L-卡尼汀对大鼠脑缺血再灌注性损伤预防和治疗效果的对比研究*

但 丁，王晓丽，2，陈浩宇,2，梁 路,2，许 华,2，张常娥,2**

(1.广州医科大学蛋白质修饰与降解实验室，广东 广州 511436；2.广州医科大学病理生理学教研室)

缺血性脑血管病具有高发生率、高死亡率等特点，脑缺血超过一定时限后出现缺血性损伤，恢复缺血脑组织的血流是防止脑缺血性损伤的主要措施。因为氧反常、pH反常、钙反常等因素，再灌注会引发再灌注损伤[1]，但具体机制仍未完全明了，目前尚无特效药物。左旋-卡尼汀(L-carnitine，LC)[2]又名左旋肉毒碱，是机体内脂肪氧化代谢的辅助分子，可通过提高位于线粒体膜上肉毒碱脂酰转移酶的活性，促进脂肪酸代谢提供能量。有报道[3]认为LC对心肌缺血再灌注损伤具明显保护作用，但对脑缺血再灌注性损伤是否有保护作用及其机制如何少有报道。本文采用改良Zea-Longa线栓法[4]复制大鼠右侧大脑中动脉(MCAO)局灶性脑缺血再灌注模型，探讨LC对局灶性脑缺血再灌注是否具有保护性作用及其可能的机制，以期为脑缺血再灌注性损伤的发生机理提供一定的实验基础，也为该类疾病的药物开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组

SPF级成年雄性SD大鼠84只，3月龄，体质量(280±20)g。由广东省实验动物中心提供，合格证号：44007200000384/440720929。随机分成4组，每组21只，即假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注组(I/R组)、L-卡尼汀预防组(I/R+LCⅠ组)、L-卡尼汀治疗组(I/R+LCⅡ组)。所有大鼠正常饲养，保持12h光照/12h黑暗的昼夜节律。

1.1.2 药品与主要试剂

左卡尼汀购自Sigma公司，Bax抗体购自CST公司，即用型免疫组化试剂盒购自Santa Cruz公司，SOD、MDA检测试剂盒、TTC染色液(2、3、5-氯化三苯基四氮唑)购自南京建成生物工程研究所，ATP检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，HE(苏木精伊红)染色试剂购自南昌雨露实验器材有限公司。其它试剂均为国产化学分析纯。

1.2 方法

1.2.1 大脑中动脉缺血-再灌注损伤模型的复制

根据改良后Zea-Longa法，利用线栓复制大鼠右侧大脑中动脉脑缺血-再灌注模型。实验中采用0.26～0.28mm型号尼龙钓鱼线(日本生产)，用电烙铁将线的头端烤热使之变钝，距线栓的头端10mm、18mm及(18±2)mm处分别作标记，便于观察线栓插入和拔出长度。I/R组和I/R+LC组大鼠，结扎右侧颈总动脉，线栓经由颈内动脉、大脑中动脉，直至大脑前动脉，当遇到阻力线栓长度约为(18±2)mm时，即可停止插入，结扎固定线，复制出局灶性脑缺血模型。缺血2h后，拔出线栓至10mm处，此时缺血区由对侧血液经过大脑前动脉来供应，实行大脑中动脉血流再灌注24h。I/R模型的成功率超过80%，若出现术后死亡，以同窝系大鼠配齐。Sham组插入的线栓长度约10mm，其余手术操作与I/R组同。

1.2.2 L-卡尼汀药物注射

L-卡尼汀采用生理盐水配置成20mg/mL浓度备用，所有大鼠都采用腹腔注射。Sham组与I/R组：大鼠腹腔注射1mL/100g体重生理盐水；I/R+LCⅠ组(预防组)：大鼠在缺血前2h和再灌注前2h腹腔分别注射LC 200mg/kg 体重(1mL/100g体重，该剂量是根据预实验而来)；I/R+LCⅡ组(治疗组)：大鼠在再灌注开始后0h和2h分别腹腔注射LC 200mg/kg体重。

1.3 观测指标

1.3.1 神经行为学评分

根据改良后Longa法，分别对每组18只大鼠脑缺血再灌注术后2h、6h、12h和24h进行神经行为学评分。具体评分标准如下[5]：0分：大鼠自由运动，表现正常，无神经功能缺损；1分：大鼠左前爪不能自由伸展，右眼眼裂缩小，轻度神经功能缺损；2分：行走时，大鼠不停左转形成弯曲路线或咬尾，右眼明显变小，中度神经功能缺损；3分：大鼠运动向左倾倒，右眼不能睁开，重度神经功能缺损；4分：大鼠不能运动，神情松散，意识薄弱。缺血再灌注术后，麻醉清醒时评分为0分、4分及死亡的大鼠剔除，并用同窝系的大鼠进行补充，评分越高脑组织损伤越严重。

1.3.2 脑梗死灶体积的检测

每组随机取6只大鼠，在神经行为学评分和留取血液后取出全脑，快速放于-20℃冰箱中速冻20min左右，置于器官型脑片机上，冠状方向连续均匀的切成2mm左右厚脑组织片，共5片，将切好的脑组织切片置于1%TTC磷酸盐缓冲液中，37℃孵育浸染30min。染色完毕，取出脑组织切片，置于干净滤纸上，成列排布观察并拍照。正常脑组织染成红色，缺血区呈灰白色，境界清晰，呈梗死状。采用Image J 软件估算切片梗死面积百分比，将各脑片的梗死面积百分比与厚度乘积进行累加，获得梗死体积百分比。

1.3.3 血浆和脑组织SOD活性、MDA含量的测定

所有大鼠用10%水合氯醛麻醉后，开胸经左心脏取血，肝素抗凝，4℃，3000r/min离心10 min，分离血浆，如果有溶血现象就不纳入，所有血浆-20℃储存待测。每组取6只大鼠取血后，断头取脑，冰生理盐水漂洗，分离右侧大脑皮质，用生理盐水制成10%脑组织匀浆，4℃，12000g离心10min，取上清液，-20℃冻存待测。所有SOD和MDA的测定方法按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 测定脑组织ATP的浓度

每组6只大鼠断头后取出脑组织，冰上分离右侧大脑皮质，用ATP试剂盒的裂解液将右侧大脑皮质制成10%的组织匀浆，4℃，12000g离心10 min，取上清，检测匀浆液中ATP的浓度。用改良的Lowry 法定量脑组织蛋白质的含量，并计算脑组织ATP的含量。具体操作方法按照试剂盒说明书进行。

1.3.5 脑组织形态学检测

每组3只大鼠灌流固定后的脑组织采用4%多聚甲醛固定24h，用Leica2000震荡切片机(德国)进行冠状切片，厚度为20μm，放于含0.05% NaN3的0.1PB中，置于4 ℃冰箱中储备。后续进行常规HE染色，拍照进行形态学分析。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 大鼠的神经行为学评分

在大鼠缺血2h后再灌注2h、6h、12h、24h四个时间点，根据Longa法对每组18只大鼠进行神经行为学评分。与Sham组相比，I/R组、I/R+LCⅡ组大鼠神经行为学评分在四个时间点显著升高(P<0.05)，I/R+LCⅠ组在2h、6h和12h有显著性差异(P<0.05)；与I/R组相比，I/R+LCⅠ组在四个时间点神经行为学评分显著性降低(P<0.05)，I/R+LCⅡ组行为学评分虽有降低，但与I/R组相比差异无显著性(P>0.05)，见表1。

表1 神经行为学评分结果分，n=12)

与Sham组比较，*P<0.05，**P<0.01；与I/R组比较，△P<0.05

2.2 脑组织ATP含量

取右侧大脑皮质匀浆液，按试剂盒要求测定ATP的含量。经过右侧大脑中动脉缺血2h再灌注24h后，I/R组大鼠右侧脑组织ATP浓度下降，与Sham组相比，差异有显著性(P<0.01)；I/R+LCⅠ组大鼠经过缺血前2h和再灌注前2h两次预防性注射左卡尼汀注射后，与I/R组相比，右侧脑组织ATP含量组显著性增高(P<0.05)，与Con组相比，差异无显著性；但I/R+LCⅡ组大鼠经过缺血再灌注后两次卡尼汀注射，右侧脑组织内ATP含量增加不显著，与I/R组相比差异无显著性(P>0.05)，但与Sham组相比差异仍有显著性(P<0.05)，见图1(封二)。

2.3 脑梗死体积结果

大鼠经过缺血2h再灌注24h后取脑，进行TTC染色，通过Image J图形处理分析后，对梗死灶计算得出：假手术组无梗死灶，I/R组梗死灶体积百分比约为(32.30±4.12)%，与假手术组相比，差异有非常显著性意义(P<0.01)；I/R+LCⅠ组大鼠脑梗死体积显著减少，约为(13.73±3.21)%，与I/R组相比差异有显著性(P<0.05)；I/R+LC Ⅱ组大鼠脑梗死体积约为(24.27±4.77)%，与I/R组相比差异无显著性(P>0.05)。

2.4 血浆及脑组织SOD活性和MDA含量

将贮备好的血浆按照试剂盒的操作说明进行生化方法测定MDA含量和SOD活性。结果显示，大鼠经过脑缺血2h再灌注24h后，与Sham组相比，I/R组血浆中SOD活力显著性降低，MDA含量显著性升高(P<0.01)；I/R+LCⅠ组与Sham组相比，SOD和MDA的变化无显著性，与I/R组相比两者都有显著性差异(P<0.05)；I/R+LCⅡ组，血浆SOD活力和MDA含量变化与Sham组相比，差异无显著性(P>0.05)，MDA含量的变化与I/R组相比有有显著性差异(P<0.05)；见表2。

每组随机选取6只大鼠右侧大脑皮质，生理盐水制成10%的脑组织匀浆液，测定脑组织MDA含量和SOD活性。与假手术组相比，I/R组MDA含量显著升高，差异有非常显著性意义(P<0.01)，SOD值显著降低(P<0.05)；与I/R组相比，I/R+LCⅠ组MDA含量显著降低，SOD活性显著提高(P<0.05)；I/R+LCⅡ组，脑组织MDA含量显著性升高，与Sham组相比差异有显著性(P<0.05)，SOD变化不明显。见表2。

表2 血浆及脑组织MDA含量和SOD活性

与Sham组比较，*P<0.05，**P<0.01；与I/R组比较，△P<0.05

2.5 大鼠脑组织形态学变化

每组选取3只大鼠经过灌流固定后，多聚甲醛后固定24h，震荡切片，厚20μm，进行常规HE染色，观察右侧大脑的缺血区域并拍照分析。HE染色片光镜下可见：Sham组大鼠脑皮质神经元结构清晰完整，细胞排列密集整齐，神经元胞浆淡染，细胞核居中，核仁清楚，细胞浆无深红染色，细胞间隙致密无水肿。I/R组大脑皮层颞叶部位神经元数量减少逐渐明显，神经元结构紊乱，可见细胞肿胀，核固缩、碎裂、溶解等，部分细胞呈嗜酸性变；脑组织中凋亡细胞单个散在分布，表现为核染色质致密浓缩，核碎裂等；坏死细胞呈均质红染的无结构物质，核染色消失。I/R+LCⅠ组神经元损伤的神经元少见，大部分细胞结构较完整，但存在散在的坏死组织，细胞间轻微水肿。I/R+LCⅡ组，皮质细胞结构排列较整齐，但可见多个嗜酸性变细胞及散在的凋亡细胞，细胞间质水肿比较严重。见图2(封二)。

3 讨 论

脑缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，I/R Ⅰ)是一个十分复杂的病理生理过程，I/R Ⅰ的发生机理涉[6]及能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性、Ca2+超载、自由基损伤、炎症反应、细胞凋亡等，但具体机制仍未完全明了，目前仍是研究的热点。本实验通过线栓法复制大鼠右侧大脑中动脉脑缺血再灌注模型，缺血2h后再灌注24h。通过神经行为学评分，从2h开始，大鼠行为学显示皮质神经元损伤严重，右眼明显缩小，Hornor症典型，恢复血液灌注24h后，这种神经元损伤持续存在，这可能与再灌注性损伤有关。经检测发现脑组织ATP含量减少，脑组织和血液的MDA含量增加、SOD活力下降，HE染色发现大量的神经细胞发生变性和死亡，部分细胞呈现凋亡特征，另有部分细胞坏死溶解。这些结果说明本模型大鼠局灶性脑缺血后，脑组织能量代谢障碍，即使血液再灌注24h，能量代谢并没有相应提高，反而出现了氧化应激反应，而加重脑组织缺血性损伤。

左-卡尼汀(LC)是哺乳动物体内存在的天然化合物，主要功能是促进脂类代谢，提高组织器官的脂肪酸氧化供能。LC主要促进肌肉细胞尤其是心肌细胞脂肪酸的能量代谢，脑、肾等许多组织器官亦能脂肪酸氧化供能。LC还能增加细胞色素C还原酶、细胞色素氧化酶的活性，加速ATP的产生[7]。

本实验中，I/R+LC Ⅰ组大鼠脑缺血前2h和再灌注前2h分别腹腔注射200mg/kg的LC，相当于预防性给药。与I/R组相比，该组大鼠神经行为学评分发现在相对应的时间内，大鼠神经损伤显著减轻；检测血浆和脑组织各项指标发现，脑组织中ATP含量显著升高，血浆和脑组织中SOD活力增加，MDA的含量下降，说明大鼠脑组织能量产生增加，抗氧化应激的能力增强。通过形态学检测发现，LC能减少坏死的神经细胞数量和细胞凋亡的程度。这些结果表明LC对脑缺血再灌注性损伤有明显的预防作用。而I/R+LC Ⅱ组大鼠，在再灌注开始0h和再灌注2h分别腹腔给予200mg/kg的LC，相当于治疗性给药，该组大鼠所有的检测指标显示，LC对I/R I的改善作用不明显，说明LC对脑缺血再灌注性损伤的治疗效果不理想。

从本研究的上述结果综合推测，LC对脑缺血再灌注性损伤有预防作用，其机理可能涉及能量代谢的改善、抗氧化和抗凋亡等作用，是否还存在其它机制，尚需要进一步研究。

[1]王万铁.病理生理学[M].北京.人民卫生出版社，2011：141

[2]高宏民，李尚俭，朱火兰，等.左卡尼汀通过内质网应激ATF6通路抑制高糖诱导的HAECs凋亡[J].中国病理生理杂志，2017，33(8)：1449

[3]NAJAFI M，GARJANI A.Short term administration of L-carnitine can be detrimental to the ischemic heart[J].Advanced Pharmaceutical Bulletin，2014，4(1):1

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[5]曹勇军，程彦斌.线栓法建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的改进与探讨[J].中国应用生理学杂志，2001，17(2)：198

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