假性甲状旁腺功能减退症患者临床特点和GNAS突变分析

吴云芳，刘靖芳，汤旭磊，杨晓梅

(兰州大学第一医院 内分泌科，甘肃 兰州 730000)

假性甲状旁腺功能减退症患者临床特点和GNAS突变分析

吴云芳，刘靖芳*，汤旭磊，杨晓梅

(兰州大学第一医院 内分泌科，甘肃 兰州 730000)

假性甲状旁腺功能减退症(pseudohypoparathyroidism，PHP)是一种以靶器官(骨、肾脏)对甲状旁腺激素(parathy-roid hormone，PTH)抵抗为特征，临床上以低钙血症、高磷血症和血液循环中PTH增加为主要临床表现的家族遗传性疾病。部分患者具有多种先天性生长和骨骼发育缺陷：如身材矮小、圆脸、肥胖、短颈、指(趾)粗短、异位钙化灶、甚至智力发育障碍等。研究显示PHP发病与G蛋白α基团(GNAS)突变有关[1]。本文对兰州大学第一医院内分泌科收治的一例PHP患者及其父母的临床特点和GNAS突变进行分析，从分子水平了解该病的发病机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 临床资料：患者女性，7岁，因“间断四肢抽搐2年，发现血钙降低5 d”收住院。患者于入院前2年开始每于情绪紧张时反复出现四肢抽搐，每次发作持续时间不定，均可自行缓解，发作时意识清楚，伴头痛、恶心，偶有呕吐，呕吐物为胃内容物，无头晕、耳鸣及视物旋转等不适。患者足月顺产，无窒息及缺血缺氧史，生长发育过程中智力及体型均正常。查体： 身高125 cm， 体质量25 kg。发育正常， 神志清楚，圆脸，全身无浮肿，甲状腺无肿大，四肢无畸形，肌力及肌张力均正常，Trousseou征阳性，智 商测试评分75 分(中等智力)。实验室检查：血钙1.65 mmol/L(正常值2.10～2.80 mmo/L)，血磷2.77 mmol/L(0.97～1.60 mmol/L)。碱性磷酸酶350.0 U/L(20～125 U/L)，骨特异性碱性磷酸酶125.50 μg/L(4.6～14.3 μg/L)，25-羟-维生素D 42.93 nmol/L(47.7～144 nmol/L)，PTH 1347.0 pg/mL(16～87 pg/mL)。尿钙0.2 mmol/24 h(2.5～7.5 mmol/24 h)，尿磷8 mmol/24 h(23～48 mmol/24 h)。肝肾功及甲状腺功能检查均正常。跟骨骨密度检查：左脚T值-1.2。双手正位片示：骨小梁稀疏，干骺段膨大，考虑轻度脱钙表现(图1)。头颅X线片未见明显异常。

1.1.2 家系资料：患者父母智力、身高及体质量均正常，体型正常。家族中无类似发病史。家系中成员无近亲婚配史。

1.1.3 主要试剂：100 bp DNA分子质量标准、DNA提取试剂、Tap DNA聚合酶及PCR扩增试剂(上海生工公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取：取患者及其父母外周静脉血各5 mL，EDTA抗凝，提取外周血白细胞DNA，-20 ℃冰箱保存。

A.hands anteroposterior radiograph；B.hands oblique radiograph图1双手正斜位片Fig 1 Hands anteroposterior and oblique radiographs

1.2.2 PCR扩增GNAS第1-13号外显子： PCR扩增患者及其父母GNAS第1-13号外显子，根据GNAS序列，使用Primer 5软件设计对1-13外显子的特异性引物(表1)。按照下列条件进行PCR扩增反应：基因组DNA 1 μL，dNTP 0.5 μL，Tap聚合酶0.2 μL，Tap缓冲液2.5 μL，引物各0.5 μL，加水20 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～60 s，循环35次，最后72 ℃修复延伸10 min。PCR产物4 ℃保存。

1.2.3 PCR产物纯化和测序：PCR产物送至上海生物工程股份有限公司，在3730XL自动测序仪上进行测序。用SepMan软件将获得的序列与GenBank所提供的外显子序列进行对比，以确定突变位点。

2 结果

DNA测序显示，该患者GNAS第5外显子393位核苷酸发生C→T，该定义为同义突变，其所编码的131位氨基酸仍为异亮氨酸，该改变考虑为SNP位点：c.393C>T(p.I131I)。其父亲和母亲GNAS未发现突变位点(图2)。

3 讨论

本例患者出生后第5年开始间断性出现四肢抽搐及下颌抖动，多于情绪紧张时诱发，实验室检查提示低血钙、高血磷、低尿钙、低尿磷、高PTH血症，伴有血碱性磷酸酶升高，故PHP诊断明确。

本研究中对患者及其父母进行GNAS突变检测，仅发现1个SNP位点，位于第5外显子(c.393C>T)，国内亦有类似文献报道，所发现的SNP位点分别位于：第二内含子33位碱基G/A，第5外显子81位碱基C/T，第13号外显子293位碱基G/A，第2号外显子c.212A>C(p.E71D)，第5外显子c.393C>T(p.I131I)[2]。考虑国内散发性PHP患者对该疾病的易感性可能与GNASSNP位点相关。本研究中该PHP患者GNAS1-13外显子区域未发现有意义的突义的突变，考虑可能与以下因素有关：1)突变存在于GNAS的其他区域，如启动子区、调控序列或内含子区；也可能发生GNAS亚微观缺失或甲基化缺失[3]。2)可能存在除GNAS以外的其他基因突变，如PRKAR1A、PDE4D等基因突变[3]，具体的机制尚需进一步研究。

表1 扩增GNAS第1-13号外显子的引物序列Table 1 Primer Sequences of GNAS 1-13 exons

A.patient; B.mother; C.father图2 GNAS第5外显子测序结果Fig 2 Sequencing of PCR product of GNAS in exon 5

[1] Mantovani G, Spada A, Elli FM.Pseudohypoparathyroidism and Gsα-cAMP-linked disorders:current view and open issues[J].Nat Rev Endocrinol,2016,12:347- 356.

[2] 陈燕燕，孙晓芳，袁鹰.假性甲状旁腺功能减退症Ⅰa型临床与基因分析[J].中华临床医师杂志(电子版)，2014，8：576- 580.

[3] Elli FM, DeSanctis L, Ceoloni B,etal.Pseudohypoparathyroidism type Ia and pseudo-pseudohypoparathyroidism: the growing spectrum of GNAS inactivating mutations[J].Hum Mutat,2013,34:411- 416.

2016- 12- 19

2017- 03- 23

*通信作者(correspondingauthor)：ljf824168@126.com

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