p66Shc在心力衰竭大鼠血清中的表达及与氧化应激的关系

马晶 李锦玉⋆

p66Shc在心力衰竭大鼠血清中的表达及与氧化应激的关系

马晶 李锦玉⋆

目的 检测p66Shc在心力衰竭大鼠血清中的表达并探讨其与氧化应激的关系。方法 SD大鼠分为心力衰竭组（HF组）和正常对照组（对照组）。检测心力衰竭大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）的活力及丙二醛（MDA）的含量；超声心动图检测心室舒张末内径（LVEDD）、左心室收缩末内径（LVESD）、左室射血分数（LVEF）；RT-PCR检测血p66Shc mRNA的表达，并对p66Shc的表达与LVEDD、LVESD、LVEF、MDA、SOD进行相关分析。结果 心力衰竭组SOD、LVEF明显下降，MDA、p66Shc明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；心力衰竭组p66Shc mRNA的表达量与LVEDD、LVESD、MDA呈正相关（r=0.636、0.620、0.645，P＜0.05），而与LVEF、SOD呈负相关（r=-0.860、-0.650，P＜0.05）。结论 p66Shc与心力衰竭氧化应激密切相关，p66Shc可能参与心力衰竭氧化应激的过程，可为心力衰竭新的治疗途径提供依据。

心力衰竭 氧化应激 p66Shc 超氧化物歧化酶 丙二醛

Objective To investigate the expression of adaptor protein p66shc in rats with heart failure and its relationship with oxidative stress. Methods Rat heart failure model was established by partially banding abdominal aorta.The levels of serum superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）activity were examined.The left ventricular end diastolic diameter（LVEDD），left ventricular end systolic diameter（LVESD），left ventricular ejection fraction（LVEF）were measured by routine cardiac ultrasonography.The expression of p66Shc was determined by quantitative real time PCR. Results The levels of SOD and LVEF were signif i cantly lower while the levels of MDA and p66Shc were signif i cantly higher in HF group than that in control group（P＜0.05）.Linear correlation analysis showed that the expression of gene p66Shc was positively related with the level of LVEDD，LVESD and MDA（P＜0.05），but negative related with the level of LVEF and SOD（P＜0.05）.Conclusion P66shc is associated with states of increased oxidative stress. P66shc mRNA levels are increased in HF，which may be involved in the pathogenesis of HF through oxidative stress.

Heart failure，congestive Oxidative stress P66Shc SOD MDA

心力衰竭是临床常见的心血管病，是各种心脏病发展的终末阶段［1］。细胞活性氧的产生是心力衰竭心肌损伤发生的关键环节。p66Shc是一种新型长寿调节基因，在调控细胞氧化应激和细胞生命周期凋亡中发挥及其重要的作用。本研究通过测定心力衰竭大鼠和健康大鼠p66Shc、脂类氧化应激标记物丙二醛（MDA）、抗氧化酶类超氧化物歧化酶（SOD）表达水平，评估左心室舒张末内径（LVEDD）、左心室收缩末内径（LVESD）、左室射血分数（LVEF），探讨p66Shc与MDA、SOD的表达水平改变与心力衰竭的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年SD大鼠（Ⅱ级）40只，雌雄各半，由复旦大学实验动物学部提供，8周龄，体重（200±20）g。本动物实验于2016年4月至6月在本院动物实验中心完成。

1.2 动物分组及模型建立 SD大鼠40只随机分为正常对照组（对照组）和心力衰竭组（HF组），每组各20只。以腹主动脉缩窄法建立左室压力负荷心力衰竭模型。以4%戊巴比妥钠腹腔麻醉，分离右肾动脉起始部约1.0cm处，27号注射针头平行放置于腹主动脉上，4号丝线一并结扎，造成腹主动脉狭窄，且腹主动脉直径缩窄为0.9mm，然后抽出针头，关腹缝合。经右侧颈总动脉插管至左心室，测量左室舒张末压（LVEDP），LVEDP≥15mmHg为心力衰竭成模的标准。正常对照组钝性分离后，缝合线仅绕于腹主动脉上，不结扎。

1.3 超声心动图检测 8周后存活的大鼠行超声心动图检测LVEDD、LVESD，求3个心动周期的平均值，并按照Teichholtz公式计算LVEF。

1.4 血清MDA含量、SOD活力检测 第8周大鼠麻醉后采血，置于离心机中以3500r/min离心20min。取上清液，采用TBA法检测血清MDA含量，黄嘌呤氧化酶法检测血清中SOD活力。实验步骤按试剂盒说明书操作。

1.5 血清p66Shc mRNA表达检测 第8周采集晨时空腹静脉血5ml，采用美国sigma公司1077淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，将稀释的血液缓慢加入到15ml分离液的液面上以2000r/min梯度离心20min，收集并洗涤云雾状单个核细胞层，加入磷酸缓冲溶液重悬，于-80℃冰箱保存。采用Trizol法提取单核细胞中总RNA。加入1ml Trizol充分溶解细胞，加入0.2ml氯仿，用手剧烈震荡30s，静置2min，4℃条件下14000r/min离心20min，取上清液，加入0.5ml异丙醇混匀，-20℃静置10min，14000r/min 4℃离心20min，弃去上清液，沉淀加入1ml 100%乙醇洗涤1次，4℃，14000r/min离心5min，弃去上清液；沉淀在室温中放置10min晾干，加入20μl无RNA酶的ddH2O溶解，取1μl用紫外分光光度计测定提取的RNA纯度及浓度，A260/A280在1.8～2.0。使用AB公司7500荧光定量PCR仪，按照试剂盒说明书操作，将RNA逆转录成cDNA，进行定量PCR检测p66Shc mRNA表达水平，使用相对定量方法（2—ΔΔCt）计算p66Shc表达量。p66Shc上游引物为5'-GAAGAGCCACCTGACCATC-3'，下游引物为5'-AGGCACCCGAAGAGCATC-3'；β-actin上游引物为5'-CGTGAAAAGACCCAGATCA-3'，下游引物为5'-CACAGCCTGGATGGCTACGT-3'。反应条件：95℃ 30s；95℃ 5s；60℃ 34s，40个循环。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。正态分布计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，相关性采用线性相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠心脏超声及血清各指标比较 见表1。

表1 两组心脏超声、血清MDA含量等指标比较（x±s）

2.2 HF组p66Shc mRNA与LVEDD、LVESD、LVEF、MDA、SOD的相关性分析 相关分析显示，p66Shc mRNA与LVEDD、LVESD、MDA呈正相关（r=0.636、0.620、0.645，P＜0.05），而 与 LVEF、SOD 呈负相 关（r=-0.860、-0.650，P＜0.05）。

3 讨论

心力衰竭是多种心血管疾病的共同结局，是心脏病患者死亡的主要原因。氧化应激是指机体或细胞内氧自由基的消长失衡，引起活性氧在体内蓄积的一种状态，且超出机体对于氧化物的清除能力，因而对机体的组织器官造成损失的过程［2］。氧化应激是心血管疾病的重要特征之一。SOD和MDA显示组织的脂质过氧化程度。心力衰竭时，神经内分泌系统的激活，增加内皮细胞活性氧的产生，减少抗氧化物质的表达，激活氧化应激系统，参与心力衰竭的发生、发展过程。本资料结果显示，HF组SOD明显下降，MDA明显升高，提示氧化应激参与心力衰竭的发生过程。

p66Shc是调控细胞氧化应激和细胞生命周期凋亡的关键蛋白，是线粒体活性氧产生的关键调节蛋白。自1999年首次报道p66Shc基因敲除的小鼠寿命、细胞活性氧及其诱导的凋亡明显下降后，国内外学者对p66Shc 功能进行大量研究［3］。Kumar 等［4］研究显示，p66Shc可调控糖尿病诱导的血管氧化应激和内皮功能障碍。p66Shc基因敲除的小鼠缺血预处理后无心肌梗死面积的减少。抑制p66Shc介导的线粒体凋亡可减少大鼠肠缺血再灌注损伤［5］。本资料中，HF组p66Shc明显高于对照组，且p66Shc与LVEDD、LVESD呈正相关，而与LVEF呈负相关，提示p66Shc与心力衰竭的发生发展密切相关。

p66Shc由广泛表达于多种组织细胞中的Shc A基因编码，分为p46Shc、p52Shc和p66Shc3种亚型。而p66Shc与p46Shc、p52Shc区别在于其N末端具有独特的CH2结构域，该结构域Ser36位点经PKC-β磷酸化激活后，再经异构化，去磷酸化过程，转移至线粒体内，发挥促进活性氧产生的作用［6］。Derungs等［7］研究发现，p66Shc在阿尔茨海默病的线粒体功能障碍和体内氧化损伤中发挥作用，p66Shc消融可能是针对阿尔茨海默病认知障碍的新型治疗方法。急性冠状动脉综合征患者血单个核细胞p66Shc水平比稳定性冠心病和正常对照明显升高，且氧化应激也增强，提示p66Shc介导的活性氧可能与斑块破裂相关。本资料HF组p66Shc的表达量与MDA水平呈正相关，与SOD呈负相关，提示p66Shc的表达水平与心力衰竭氧化应激密切相关，p66Shc可能参与心力衰竭氧化应激的过程。

［1］ 张开坤,吴世良.比索洛尔和美托洛尔治疗慢性心力衰竭的疗效观察. 浙江临床医学,2017,19(4)：680-682.

［2］ 冯学问,林海洋,仇晨峰.氧化应激水平与2型糖尿病眼肌麻痹关系的初步研究. 浙江临床医学,2015,17(2)：190-192.

［3］ 李声娜,张新林,黄为. p66Shc与心血管疾病. 中华心血管病杂志,2014,42(11)：977-980.

［4］ Kumar S,Kim YR,Vikram A,et al. Sirtuin1-regulated lysine acetylation of p66Shc governs diabetes-induced vascular oxidative stress and endothelial dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2017, 114(7)：1714-1719.

［5］ Feng D,Yao J,Wang G,et al. Inhibition of p66Shc-mediated mitochondrial apoptosis via targeting prolyl-isomerase Pin1 attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury in rats. Clinical Science, 2017,131(8)：759-773.

［6］ Edwards NA,Watson AJ,Betts DH,et al. P66Shc,a key regulator of metabolism and mitochondrial ROS production,is dysregulated by mouse embryo culture. Mol Hum Reprod,2016,22(9)：634-647.

［7］ Derungs R,Camici GG,Spescha RD,et al. Genetic ablation of the p66Shc adaptor protein reverses cognitive deficits and improves

上海市浦东新区卫生科技项目（PW2015B-17）

201399 上海市浦东医院

*通信作者