左乙拉西坦联合替莫唑胺作用于胶质瘤细胞的体外研究

吴庆武 张宗平 王静 陈芙蓉 赵义营 曲悦 陈忠平

(1广东医科大学附属湛江肿瘤医院神经外科，广东 湛江 524002; 2中山大学肿瘤防治中心神经外科/神经肿瘤科，广东 广州 510060; 3广东药科大学药学院，广东 广州 510006)

左乙拉西坦联合替莫唑胺作用于胶质瘤细胞的体外研究

吴庆武1,2张宗平1王静2陈芙蓉2赵义营2曲悦3陈忠平2*

(1广东医科大学附属湛江肿瘤医院神经外科，广东 湛江 524002;2中山大学肿瘤防治中心神经外科/神经肿瘤科，广东 广州 510060;3广东药科大学药学院，广东 广州 510006)

目的探讨左乙拉西坦(LEV)联合替莫唑胺(TMZ)作用于胶质瘤细胞的效果。方法采用细胞计数试剂(CCK-8)检测并计算左乙拉西坦单药或联合替莫唑胺对人胶质瘤O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)阳性细胞系(T98G、 U138)、MGMT阴性细胞系(SKMG-4、U87)的抑制率和替莫唑胺的半抑制浓度(IC50)。结果LEV单药作用于胶质瘤细胞系，多表现出一定程度的肿瘤抑制作用，但达不到治疗作用，特别对U87的抑制作用更弱。LEV联合TMZ作用T98G、U138和SKMG-4后，TMZ的IC50均有不同程度下降(P<0.05)，但在U87上差异无统计学意义(P>0.05)。结论左乙拉西坦可抑制胶质瘤细胞(MGMT阳性和阴性)增殖，并可增敏替莫唑胺对T98G、U138和SKMG-4的疗效，但对U87 细胞没有增敏作用。

胶质瘤; 左乙拉西坦; 替莫唑胺; O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶

脑胶质细胞瘤作为最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，其中胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)为最常见的胶质细胞瘤组织类型(约占45%)，其5年生存率仅5%[1]。最好的报道也就9.8%。

在GBM患者中，约40%～60%的患者存在癫痫风险[2]。左乙拉西坦(levetiracetam, LEV)作为常用抗癫痫药物，可使76%～91%的患者免于癫痫发作[3-4]。替莫唑胺(temozolomide, TMZ)作为一线推荐的化疗药物[5]，能较明显延长患者生存时间。但其对O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase, MGMT)表达阳性的患者效果差。故如何提高TMZ对MGMT阳性胶质瘤患者疗效已成为当今研究的热点。

本实验通过LEV联合TMZ作用于胶质瘤细胞(分为MGMT阳性和MGMT阴性)的体外研究，探讨LEV能否起到增敏TMZ对胶质瘤细胞杀伤作用，从而为临床治疗胶质瘤提供相关依据。

材料与方法

一、细胞系和细胞培养

人胶质瘤MGMT阳性细胞系(T98G、U138)，MGMT阴性细胞系(SKMG-4、U87)，加入含10%胎牛血清的改良型Eagle培养基(Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)，并置于37 ℃、5% CO2加湿细胞培养箱(Thermo Fisher)中培养。以上细胞系均经复苏后，稳定传5代后用于实验。

二、LEV单药、TMZ单药及联合用药作用于胶质瘤细胞系

各个细胞系分别以500个/孔种于96孔板，设空白组(DMEM)，对照组(细胞+DMEM)，实验组[细胞+DMEM+LEV组/TMZ组/(LEV+TMZ组)]。细胞种板24 h后：①空白组和对照组：每天更换DMEM。②LEV组：第1～6天持续每天加入LEV(Sigma, 10 mg/支)，设置药物浓度10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL。③TMZ组：第1～3天更换DMEM，第4天加入TMZ(Sigma,100 mg/支)后作用3 d，设置药物浓度为50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL。④LEV+TMZ组：在持续6 d加入LEV的基础上，第4天加入TMZ(两药物浓度同上)后作用3 d。以上各组，分别于第7天加入相应体积的细胞计数试剂 (cell counting kit-8, CCK-8, Dojindo)，使CCK-8浓度均维持在10%，培养2 h后用实验系统酶联免疫检测仪(labsystems MK3 elisa, Thermo Fisher)，于450 nm处检测光密度(optical density, OD)值，然后计算细胞增殖抑制率和TMZ半抑制浓度(50% inhibitory concentration, IC50)。

三、统计学方法

结 果

一、LEV单药作用于胶质瘤细胞系的抑制率

LEV单药作用于胶质瘤细胞系，多表现出一定程度的肿瘤抑制作用，但达不到治疗作用，特别对U87的抑制作用更弱(表1和图1A～1D)。

二、TMZ组和LEV+TMZ组作用胶质瘤细胞系后TMZ的IC50

LEV联合TMZ作用T98G、U138和SKMG-4后，TMZ的IC50均有不同程度下降，差异均有统计学意义(P<0.05，表2；图2A～2C)；但在U87上差异无统计学意义(P>0.05，图2D)。

CelllinesInhibitoryrate(%)ControlLEV10μg/mLLEV20μg/mLLEV40μg/mLLEV80μg/mL T98G0±2.533.8±2.8a35.2±1.6a38.4±3.2a33.7±2.6a U1380±4.825.3±5.5a24.7±5.8a31.2±4.0a27.0±4.6a SKMG-40±7.835.8±2.6a33.9±10.8a28.0±7.2a33.3±7.2a U870±5.310.8±7.65.1±2.1a11.5±4.5a8.5±9.5

aP<0.05,vscontrol group.

CelllinesIC50TMZTMZ+LEV10μg/mLTMZ+LEV20μg/mLTMZ+LEV40μg/mLTMZ+LEV80μg/mL T98G446.0±29.5252.3±26.9a258.3±48.9a209.0±14.4a201.0±52.3a U138163.9±4.4119.3±14.0a126.5±9.5a107.3±8.6a112.2±14.4a SKMG-4200.6±8.588.7±2.1a91.0±2.0a89.3±8.3a98.3±9.2a U87122.2±7.0134.9±22127.2±20.2114.2±24.4121.3±24.5

aP<0.05,vsTMZ group.

图1 LEV单药作用于T98G、U138、SKMG-4和U87的效果

Fig 1 The effect of LEV on glioma cell lines T98G, U138, SKMG-4 and U87

A: T98G; B: U138; C: SKMG-4; D: U87.

aP<0.05,vscontrol group.

图2 TMZ单药或联合LEV作用于胶质瘤细胞后TMZ的IC50

Fig 2 IC50 of TMZ after being treated with TMZ alone or in combination with LEV

A: T98G; B: U138; C: SKMG-4; D: U87.

aP<0.05,vsTMZ group.

讨 论

由于胶质瘤患者手术后发生癫痫的概率比较高，因此，在胶质瘤患者的治疗过程中，抗癫痫药物的使用是比较普遍的[6]。肝酶诱导作用的抗癫痫药物会影响抗肿瘤药物的疗效已广为认识，但抗癫痫药物本身对胶质瘤是否有何影响了解的还不多。

最近，Lee等[7]尝试了10多种临床应用的抗癫痫药物对胶质瘤细胞生长的作用，发现虽然大多数抗癫痫药对胶质瘤细胞有生长有抑制作用，但多是轻微的，达不到IC50，只有奥卡西平(oxcarbazepine, OXC)和丙戊酸(valproic acid, VPA)表现出了明显的抑制胶质瘤细胞 T98G和U87生长，抑制率超过50%。然而，到达明显细胞生长抑制时的药物浓度已远超出了其最大耐受剂量，因此，在临床上并不能作为抗肿瘤药物。

一些研究表明LEV可以抑制T98G和U138细胞的增殖，该药浓度范围为5 μg/mL至80 μg/mL，抑制率为5%～30%，均没有达到IC50[7-8]。本研究LEV单药作用于人胶质瘤MGMT阳性细胞系(T98G、U138)和MGMT阴性细胞系(SKMG-4、U87)，均表现出不同程度抑制细胞增殖的作用，抑制率为5.1%～38.4%，但也都没有达到50%的抑制率。可见，要单独应用LEV作为抗胶质瘤治疗并没有临床实际价值。

本研究表明LEV联合TMZ作用T98G、U138和SKMG-4后可以明显降低TMZ的IC50，也就是起到增敏TMZ对胶质瘤细胞杀伤作用。Bobustuc等[8]的研究提示，LEV可以通过mSin3A和组蛋白脱乙酰基酶1(histone deacetylase1, HDAC1)形成共抑制复合物，抑制P53介导的MGMT表达，从而增强TMZ对于MGMT阳性细胞的疗效。然而，LEV怎样增敏TMZ对MGMT阴性细胞(SKMG-4)的疗效，具体机制有待进一步研究。

需要特别关注的是，Lee 等的研究发现 LEV 对胶质瘤 U87具有轻微的促进生长作用(虽然这不具有统计学意义)[7]，与我们的研究结果(对U87细胞具有抑制作用)并不一致。分析研究方法发现，我们是在培养6 d中每天给予LEV，而Lee他们的试验中LEV仅用一次。由此我们推测，LEV短时间运用、长时间的作用于U87细胞的机制是不同的，故临床上可考虑长时间使用更有利。

此外，我们的研究发现，LEV在U87细胞并没有起到对TMZ增敏的作用，其原因还需要深入探索：如果是因为U87为MGMT阴性细胞？那么同样SKMG-4也是MGMT阴性表达，却LEV具有对TMZ增敏作用。

在临床研究上，LEV已被证实可改善胶质瘤患者预后[9]及其认知功能[10]。最近另一临床回顾分析亦显示，TMZ联合LEV者比未联合LEV者治疗GBM的效果好。前者在中位无进展生存期(progression-free survival, PFS)和总生存时间(overall survival, OS)较后者明显延长，两组PFS和OS分别为9.4 m ∶6.7 m和25.7 m ∶16.7 m[11]。

综上所述，我们的实验表明LEV对胶质瘤细胞具有微弱的抑制生长作用，并在多数胶质瘤中可以增加对TMZ的敏感性。因此，临床上在胶质瘤患者治疗特别是 TMZ化疗过程中同时应用LEV，是个可以推荐的方案：既起到抗(预防)癫痫作用，又抑或提高TMZ的疗效。

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Invitrostudyofantitumoreffectoflevetiracetamcombinedwithtemozolomideingliomacelllines

WUQingwu1,2,ZHANGZongping1,WANGJing2,CHENFurong2,ZHAOYiying2,QUYue3,CHENZhongping2

1DepartmentofNeurosurgery,AffiliatedZhanjiangCancerHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524002;2DepartmentofNeurosurgery/Neuro-oncology,SunYat-SenUniversityCancerCenter,Guangzhou510060;3CollegeofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006, China

ObjectiveThe antitumor effect of levetiracetam (LEV) combined with temozolomide (TMZ) was investigated in glioma cell lines.MethodsThe cell proliferation with cell counting kit-8 (CCK-8) assay was performed in two O6-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) positive cell lines (T98G and U138) and two other MGMT negative cell lines (SKMG-4 and U87). The cells were treated with LEV and TMZ alone or in combination.ResultsLEV inhibited the proliferation of glioma cell lines but did not reach the therapeutic effect, especially in U87. The 50% inhibitory concentration (IC50) of TMZ was significantly decreased in cell lines (T98G, U138 and SKMG-4,P<0.05) which were treated with TMZ and LEV with no significant changes in U87 (P>0.05).ConclusionLEV may inhibit the proliferation of glioma cell lines (both MGMT-positive and MGMT-negative) and also sensitizes the cell lines (T98G, U138 and SKMG-4, but not U87) to TMZ.

Glioma; Levetiracetam; Temozolomide; MGMT

1671-2897(2017)16-217-04

国家自然科学基金资助项目(81372685)；国家重点基础研究发展计划基金资助项目(2015CB755505)；广东省科技计划基金资助项目(2013B021800067)

吴庆武，主治医师，E-mail: wuqingwu@yahoo.com

*通讯作者： 陈忠平，教授，E-mail: chenzhp@sysucc.org.cn

R 739

A

2016-11-30；

2017-02-27)