芍药苷抑制Src/STAT3信号通路协同替莫唑胺抑制胶质瘤细胞增殖和迁移

高卓维 陈广鸿 符路娣

1广州中医药大学顺德医院（广东佛山528300）；2南方医科大学中医药学院分子生物学实验室国家中医药管理局三级科研实验室（广州510515）；3广州中医药大学实验动物中心（广州510405）

胶质瘤是人类中枢神经系统中非常常见的恶性肿瘤，具有生长迅速、侵袭性强、病死率高和致残率高的特点，约占成人恶性脑肿瘤的81%［1］。目前，胶质瘤主要的临床治疗方法是手术切除结合术后放疗、化疗的综合疗法［2-3］。替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）是用于神经胶质瘤治疗的一线化疗药物，具有明确的疗效。然而替莫唑胺的疗效经常受到药物敏感性下降和化疗耐药性的限制。既往研究发现传统化疗药物联合中药，能够增加抗癌疗效和减轻单药不良反应。芍药苷（Paeoniflorin）是临床常用中药芍药内的主要有效成分，近年来的研究发现芍药苷具有抗肿瘤作用，能够抑制多种肿瘤的生长［4］。本研究对芍药苷协同替莫唑胺抑制原代脑胶质瘤细胞的作用进行研究，观察联合作用对原代脑胶质瘤细胞体外增殖和迁移的影响，探讨芍药苷协同替莫唑胺治疗胶质瘤的量效关系和作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料c-Myc（#18583）、MMP-2（#40994）、MMP-9（#13667）、GAPDH（#5174）抗体购自美国CST生物科技有限公司，Src（ab109381）、p-Src（Tyr419，ab185617）、STAT3（ab68153）、p-STAT3（Tyr705，ab76315）、CyclinD1（ab134175）购自美国Abcam有限公司。芍药苷由广东药科大学仇志坤博士馈赠、替莫唑胺购买自左克有限公司。MTS购买自Promega有限公司。结晶紫染色液购买自凯基生物科技有限公司。DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶购买自美国Gibco公司。

1.2 细胞培养采用组织块培养法提取胶质瘤原代细胞。其中：人脑胶质瘤瘤体组织来自广州中医药大学顺德医院神经外科术后的病理标本。成功提取的原代脑胶质瘤细胞用含10%FBS的DMEM培养基培养，置于5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。在生长至80%进行传代，用0.25%胰蛋白酶（含0.2%EDTA）消化细胞，并转移到新培养皿中进行进一步培养。实验所用原代胶质瘤细胞控制在4代以内。本研究经过原佛山市顺德区中医院伦理委员会审查。

1.3 MTS 法检测原代脑胶质瘤细胞增殖活力取对数生长期的原代脑胶质瘤细胞，消化、离心，调整细胞密度至5 × 103个接种于96孔板中，待细胞贴壁长至约80%后，分别给予不同浓度的芍药苷或替莫唑胺处理，培养24或48 h后，弃培养基，每孔加入100 μL MTS稀释液（将MTS试剂以1∶6的比例加入至含1%FBS的DMEM培养基中），于37°C，5%CO2孵箱孵育1 h，酶标仪检测吸光度并计算细胞活力。细胞活力=［OD-OD（空白）］/［OD（对照）-OD（空白）］×100%。在确定芍药苷和替莫唑胺的抑制浓度后，检测两者药物组合对原代胶质瘤细胞活力的影响。通过绘制等效线图和计算组合指数CI（CI ＜1，协同作用；CI = 1，相加作用；CI ＞1，拮抗作用）来确定最佳协同作用的药物比例。以此为依据设定给药浓度进行后续EdU染色、Transwell细胞迁移和Western blot检测。

1.4 EdU 染色检测细胞增殖能力取对数生长期的原代脑胶质瘤细胞，消化、离心、调整细胞密度至5 × 103个接种于96孔板中，待细胞贴壁长至约80%后，分为对照组、芍药苷组、替莫唑胺组、芍药苷+替莫唑胺组，并在培养基中加入EdU处理48 h后，4%多聚甲醛固定细胞，然后分别依次采用1×Apollo®染色液和1×Hoechst33342反应液室温孵育各30分钟。在荧光显微镜下随机计数3个视野中细胞总数（呈蓝色）及EdU阳性细胞数（呈红色），EdU阳性百分比= EdU阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.5 Transwell 细胞迁移实验取对数生长期的原代脑胶质瘤细胞，按照约1 × 105个/孔的细胞密度分别用500 μL含不同药物的含药无血清DEME培养基重悬后加入Transwell小室上室，下室置于含10% FBS的DMEM培养基的24孔板中，孵箱中孵育16 h，孵育结束后弃去培养基，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色液染色15 min，最后棉签旋转轻柔地擦去上室未迁移的细胞。于倒置显微镜下每组随机选取5个视野进行拍照计数。Image J软件统计每组迁移细胞数。

1.6 反向药效团对接即使探索芍药苷治疗胶质瘤的作用靶点通过TCMSP数据库下载（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）芍药苷的空间构象，将芍药苷的3D结构上传到反向药效团对接分析数据库PharmMapper（http：//lilab-ecust.cn/ pharmmapper/）进行分析，寻找芍药苷潜在作用靶点。候选靶点经过筛选后通过STRING数据库（https：//string-db.org/）分析其相互作用。

1.7 细胞蛋白检测将原代脑胶质瘤细胞在6孔板上培养，待生长至80%将细胞分为对照组、芍药苷组、替莫唑胺组、芍药苷+替莫唑胺组。培养48 h后弃培养基，并用预冷的PBS洗涤。每孔加入100 μL RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）裂解。收集裂解五转移至1.5 mL EP管中，漩涡振荡3 min，然后4 ℃，12 000 ×g，离心15 min。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质，然后将其转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶封闭PVDF膜，并用TBST溶液洗涤3次，每次5 min/次。一抗（1∶1 000）4℃摇床孵育过夜。洗涤后在室温下与二抗（1∶5 000）孵育1 h，采用ECL化学发光液曝光。使用GAPDH作为内参。

1.8 统计学方法实验结果数据以均数±标准差表示，SPSS 19.0软件对数据进行统计学处理。IC50计算采用概率分析法，组间多样本均数比较采用ONE WAY ANOVA进行分析，P ＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 芍药苷和替莫唑胺对原代脑胶质瘤细胞活力的影响结果如图1示，替莫唑胺和芍药苷单药对原代脑胶质瘤细胞的生长均具有抑制作用，并且其抑制作用呈剂量和时间依赖性。作用24、48 h后替莫唑胺的IC50值分别是404.15、191.57 μmol/L。作用24、48 h后芍药苷的IC50值分别是96.79、69.85 μmol/L。两药联合等效图结果显示，替莫唑胺与芍药苷联合应用时，对原代脑胶质瘤细胞的生长抑制作用明显增强。与6.25、12.5、25 μmol/L的芍药苷联合应用处理后，替莫唑胺的IC50值分别为159.68、107.84、65.54 μmol/L，较单独应用时的IC50明显降低（P ＜0.05）。等效线图分析显示，芍药苷联合替莫唑胺的CI值明显小于1，在芍药苷浓度为6.25、12.5、25 μmol/L时CI值分别为0.96、0.82、0.86提示两药联合呈明显协同作用。

图1 芍药苷协同替莫唑胺抑制对胶质瘤细胞活力Fig.1 Paeoniflorin united temozolomide inhibites the cell viability of glioma cells

2.2 芍药苷协同替莫唑胺抑制脑胶质瘤细胞增殖采用EdU增殖染色法检测不同处理对原代脑胶质瘤胶质瘤细胞增殖能力的影响，如图2A所示，图中蓝色的细胞（Hoechst 33342）代表所有细胞的细胞核，红色的细胞（EdU）代表增殖细胞。统计分析发现，与对照组比，芍药苷（25 μmol/L）、替莫唑胺（100 μmol/L）和两药联合组（芍药苷25 μmol/L +替莫唑胺100 μmol/L）均能抑制原代脑胶质瘤的增殖能力（P ＜0.05）。与芍药苷和替莫唑胺单药相比较，两药联合对原代脑胶质瘤细胞的增殖抑制作用更强（P ＜0.05）。EdU染色结果与MTS结果一致，提示芍药苷协同替莫唑胺抑制原代脑胶质瘤胶质瘤细胞增殖。

2.3 芍药苷协同替莫唑胺抑制脑胶质瘤细胞迁移分别用不同处理原代脑胶质瘤细胞16 h后，采用Transwell细胞迁移实验检测原代脑胶质瘤细胞的迁移能力，如图2C所示，对照组、芍药苷（25 μmol/L）、替莫唑胺（100 μmol/L）和两药联合组（芍药苷25 μmol/L +替莫唑胺100 μmol/L）每视野的迁移细胞数分别为196.7 ± 14.5、98.0 ± 11.5、65.0±14.5、43.6±6.02个。芍药苷、替莫唑胺和两药联合组均能抑制原代胶质瘤细胞的迁移能力（P ＜0.05）；与芍药苷和替莫唑胺单药相比较，两药联合对原代脑胶质瘤细胞迁移抑制作用更强（P ＜0.05）。

图2 芍药苷协同替莫唑胺抑制脑胶质瘤细胞的增殖和迁移Fig.2 Paeoniflorin united temozolomide inhibites the proliferation and migration of glioma cells

2.4 反向药效团对接技术提示Src 是芍药苷治疗胶质瘤的潜在作用靶点以Norm Fit大于0.95作为判定标准筛选反向对接结果，共对接出能与芍药苷结合的62个潜在靶点。进一步排除非胶质瘤相关的作用靶点，最终获得包括Src激酶在内的潜在靶点32个。然后通过STRING数据库分析这些潜在靶点的相互作用，结果如图3所示，Src蛋白处于较为靶点蛋白相互作用较为核心的位置。

图3 芍药苷治疗胶质瘤潜在作用靶点相互作用Fig.3 The interaction of potential targets of paeoniflorin in the treatment of glioma

2.5 芍药苷通过抑制Src/STAT3 信号通路协同替莫唑胺抑制脑胶质瘤细胞增殖和迁移采用Western blot检测Src/STAT3信号通路的表达。结果如图4所示，与对照组相比较，芍药苷组（25 μmol/L）与替莫唑胺组（100 μmol/L）均能够抑制增殖相关蛋白Cyclin D1、c-Myc以及迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达。与替莫唑胺组相比较，芍药苷组显著抑制p-Src和p-STAT3的表达。两药联用（芍药苷25 μmol/L +替莫唑胺100 μmol/L）能够显著抑制Src/STAT3信号通路的激活，并增强对Src/STAT3信号通路下游增殖以及迁移相关蛋白的抑制作用。

图4 芍药苷协同替莫唑胺对抑制脑胶质瘤细胞Src/STAT3 信号通路的影响Fig.4 Paeoniflorin united temozolomide inhibits Src/STAT3 signaling pathway in glioma cells

3 讨论

脑胶质瘤是中枢神经系统（central nervous system，CNS）最常见的原发恶 性肿瘤，年发病率为5/10万左右，多发于神经外胚层，约占颅内肿瘤的40%-50%，具有治愈率低、复发率高和病死率高的特点，患者预后不良［5］。目前对脑胶质瘤的治疗手段集中在手术、放疗与化疗三个方面，但脑胶质瘤的治疗效果仍不理想［6］。脑胶质瘤治疗中，化疗药物的耐药是脑胶质瘤治疗失败的主要原因之一，传统的药物如卡莫司汀、顺铂、替尼泊苷等临床实际有效率仅20%左右［7］。

替莫唑胺是现今胶质瘤化疗的首选药物。替莫唑胺为咪唑并四嗪类新型烷化剂，具有抗胶质瘤活性，并自上市以来已经较为广泛地应用于临床胶质瘤治疗［8-10］。国内外大型临床试验结果证明经替莫唑胺治疗后，脑胶质瘤患者的平均存活期为13 ～32个月，明显提高了生活质量，使用者的脑水肿症状得到减轻，脑肿瘤体积减小，而且未见因严重不良反应而终止治疗的报道［11］。欧洲癌症研究与治疗组织和加拿大国家癌症研究所临床试验小组进行的一项随机Ⅲ期试验发现，与单独的放疗相比，放疗基础上联合替莫唑胺治疗可改善胶质瘤患者的生存率［12］。另一项研究在老年（＞65岁）胶母细胞瘤患者中，短程放疗联合替莫唑胺，与单独短程放疗相比，能显著延长患者的总生存期和无进展生存期［13］。尽管替莫唑胺显示出一定的效果，但临床上还存在着一定的局限性［14］。因此，有必要探讨和研究联合用药以提高疗效。

芍药苷是一种水溶性单萜类糖苷化合物，普遍存在于毛茛科科植物中，是中药赤芍、白芍和牡丹的主要有效成分。芍药苷于1963年首次从芍药中提取，化学分子式为C23H28O11，分子量为480.50［15］。研究发现芍药苷具有多种药理学作用，包括抗肿瘤、抗氧化应激、抗血小板聚集以及抗炎等。芍药苷对多种肿瘤/癌症（如神经胶质瘤、胃癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌和白血病）具有良好的抗肿瘤活性［16-17］。芍药苷能够通过抑制U87、U251、T98G胶质瘤细胞中TGF-β的表达，抑制上皮-间质转化，从而增强细胞凋亡，减少细胞增殖、迁移和侵袭，并抑制裸鼠皮下移植瘤的生长［18-20］。芍药苷通过抑制胶质母细胞瘤中的HGF/c-Met/RhoA/ROCK信号通路来抑制细胞迁移和侵袭以及肌动蛋白的细胞骨架重排［21］。芍药苷能通过抑制S-期相关蛋白2的表达而发挥抗胶质瘤细胞U87的作用［22］。芍药苷通过microRNA-16上调和基质金属蛋白酶-9下调抑制胶质瘤细胞增殖和诱导凋亡［23］。除了单独作用抑制肿瘤细胞外，研究发现芍药苷能够协同多种抗肿瘤药物抑制肿瘤。芍药苷能够协同顺铂促进caspase蛋白活性，诱导膀胱癌细胞凋亡，抑制膀胱癌细胞体内的生长，并能减少顺铂治疗导致的小鼠体重下降［24］。芍药苷能够通过抑制核内NF-κB转录活性，下调抗凋亡相关基因Bcl-2的表达，协同奥沙利铂促进结肠癌细胞凋亡［25］。本研究对芍药苷协同替莫唑胺抑制胶质瘤作用进行研究，MTS结果显示芍药苷联合替莫唑胺可明显抑制原代脑胶质瘤细胞的增殖，其作用呈时间和剂量依赖性。进一步等效线图分析显示，芍药苷联合替莫唑胺的CI值明显小于1，结合EdU染色结果，进一步提示芍药苷协同替莫唑胺能够显著抑制胶质瘤细胞的体外增殖。Transwell迁移实验结果则提示，芍药苷协同替莫唑胺显著抑制胶质瘤细胞的迁移。以上结果提示芍药苷能够有效地协同替莫唑胺抑制胶质瘤细胞增殖和迁移，提高替莫唑胺对胶质瘤细胞的抑制作用并降低其给药浓度。

为了探索芍药苷协同替莫唑胺抑制胶质瘤细胞增殖与迁移的作用机制，本研究采用反向药效团对接技术寻找能与芍药苷发生结合的潜在蛋白。反向药效团对接技术是根据化学成分结构寻找靶蛋白的技术，能够为药理活性实验筛选靶蛋白，极大地提高对中药有效成分的作用机制研究的效率［26］。芍药苷的对接结果发现了包括Src在内的32个潜在靶点。Src是一种非受体蛋白酪氨酸激酶，是由原癌基因c-Src编码的一个相对分子质量为60 kd的蛋白质。Src广泛存在于组织细胞中，参与细胞的生长、发育和分化等过程，并与肿瘤的发生发展有着密切的联系［27］。既往研究发现与正常脑组织相比，胶质瘤组织标本中Src的磷酸化水平显著升高，同样地多种胶质瘤细胞系（T98G和U87）中也能观察到Src活性升高［28-30］。使用siRNA阻断Src能够增加替莫唑胺对胶质瘤的细胞毒性作用，抑制胶质瘤生长和增殖［31］。作为一种非受体酪氨酸激酶，活化的Src能够激活信号转导和转录活化因子3（signal transducers and activators of transcription，STAT3）［32］。激 活 后 的STAT3与Src同源蛋白2结构域相互作用而发生二聚化，产生的胞质同源二聚体和异源二聚体并易位至细胞核，调控包括增殖、抗凋亡、迁移、侵袭与血管新生在内的靶基因的转录，从而促进胶质瘤生长、侵袭和转移［33］。使用STAT3抑制剂能够抑制抑制STAT3下游Cyclin D1、MMP-2、MMP-9的表达，抑制胶质瘤细胞体外增殖和迁移，抑制体内移植瘤的生长［34］。本研究发现芍药苷具有抑制Src/STAT3信号通路作用，能够显著抑制p-Src以及p-STAT3的表达水平，与替莫唑胺联用能够进一步增强对增强对Src/STAT3信号通路下游增殖相关靶蛋白CyclinD1和c-Myc以及迁移相关蛋白MMP-2和MMP-9的抑制，增强抑制原代脑胶质瘤细胞增殖和迁移的作用。

综上所述，本研究的结果表明芍药苷通过抑制Src/STAT3信号通路，协同替莫唑胺抑制原代脑胶质瘤细胞的增殖和迁移，为芍药苷联合替莫唑胺药物组合应用于治疗脑胶质瘤提供了实验依据。